金磁微粒标记免疫层析快速检测方法技术

本发明专利技术提供一种金磁微粒标记免疫层析快速检测方法，旨在解决传统免疫层析分析法的检测方法在临床实践中易造成主观差异化、检测精度和灵敏度低、操作繁复、适用领域窄的问题。该检测方法的基本思想是：金磁微粒偶联抗体或配体或抗原以后在与之匹配的工作液和免疫层析装置中能够快速，定量的高灵敏度地检测被分析物。本发明专利技术既可以通过金磁微粒的特征颜色进行可目视化的判读也可通过金磁微粒磁信号的强弱对被测物进行定量检测，方法简单，成本低，能够实现人体与动植物的疾病检测，环境的检测，食品安全检测、以及毒品和药物滥用检测等。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种免疫层析分析法，具体涉及采用金磁微粒标记免疫层析的快速检 测方法，主要应用于激素、蛋白质、病毒、毒品、细菌、药物分子、毒素、重金属等检测领域。
技术介绍
现有的胶体金和乳胶颗粒标记的免疫层析分析法已经在临床医学检验中得到了 广泛的应用，其基本原理是以微孔膜为固相载体，包被目标物(即被测物)的抗原或抗体， 加入待检样本后，经微孔膜的渗滤作用或毛细作用是标本中的目标物语膜上的包被的抗原 或抗体结合，通过胶体金与之反应形成胶体金本身的颜色(红色)或者乳胶颗粒的(蓝 色)，可通过肉眼观察检测结果。但是对于某些抗原或抗体含量极低的样本，标记物的颜色 很淡几乎用肉眼难以判断结果，同时由于每个检测人视觉上的差异，也很难得到统一的判 断效果，同时对一些待检测样本的定量检测也有很大困难，虽然目前市场上有针对胶体金 等标记的免疫层析试纸条判读的仪器来减少人为原因的差异，但是这种仪器仅能对在固相 载体表面的标记物颜色检测，而对固相载体内部的标记物很难检测到，因此检测的灵敏度 受到很大限制。同时检测的生物样本中可能含有颜色物质会严重影响检测的结果和灵敏 度。
技术实现思路
本专利技术提出应用金磁微粒标记免疫层析检测条的快速检测方法，旨在解决传统免 疫层析分析法的检测方法在临床实践中易造成主观差异化、检测精度和灵敏度低、操作繁 复、适用领域窄的问题。本专利技术的基本指导思想是金磁微粒偶联抗体或配体或抗原以后在与之匹配的工 作液和免疫层析装置中能够快速，定量的高灵敏度地检测被分析物。本专利技术提出的，包括以下步骤1)金磁微粒标记待检目标物的抗体或者配体或者抗原，并溶解在层析工作液中；1. 1)取金磁微粒，用偶联缓冲液平衡3次，然后将待检目标物的抗体或配体或抗 原按照与金磁微粒质量比10 500 μ g Img加入经平衡处理后的金磁微粒中，置于0 500C >50 220rpm的空气恒温振荡器中充分反应IOmin 12h ；所述偶联缓冲液为pH = 4-9,0. 005-0. 5M的磷酸盐缓冲液、pH = 3-6,0. 1-3M的 三羟甲基氨基甲烷_盐酸溶液或PH = 6-9,0. 01-3M的醋酸盐缓冲液中的一种，所述金磁微 粒为核壳结构、组装结构、磁性氧化铁组装在核壳结构外层的金磁微粒或者基于以上三种 结构进行表面功能化修饰的金磁微粒；1. 2)于空气恒温振荡器中反应完毕，在磁性分离器上分离2 3min，弃上清，用 清洗缓冲液清洗，去除非特异性结合的分子，得到表面已固定抗体或配体或抗原的金磁微 粒；所述清洗缓冲液为下列任一溶液pH = 4-9,0. 005-0. 5M，且含有0. 5-5% Tween20或者 0. 5-5% Triton X-100 的磷酸盐缓冲液；pH = 6-9,0. 1-3M 且含有 0. 5-5% Tween20 或者0. 5-5% Triton X-100的三羟甲基氨基甲烷-盐酸溶液；pH = 3-6,0. 01-3M且含有 0. 5-5% Tween20 或者 0. 5-5% Triton X-100 的醋酸盐缓冲液；pH = 6-9,0. 1-10M 且含有 0. 5-5% Tween20 或者 0. 05-2% Triton X-100 的硼酸盐缓冲液；pH = 2-5,0. 01-1M 且含有 0. 5-5% Tween20或者0. 5-5% TritonX-IOO的甘氨酸-盐酸缓冲液；1. 3)封闭加入500ul 2ml的封闭剂到表面已固定抗体或配体或抗原的金磁微 粒中，置于20 80°C、50 220rpm的恒温振荡器中充分混勻5min 12h进行封闭；所述封闭剂是采用上述偶联缓冲液溶解了以下物质的一种或多种牛血清白蛋 白(BSA)、赖氨酸(Lys)、脱脂奶粉、乙醇胺、小牛血清、山羊血清；上述组分的终浓度均为 0. 05% -10% ；1. 4)将偶联抗体且封闭完毕的金磁微粒在磁性分离器上分离2 3min，弃上清， 用清洗缓冲液清洗，去除未结合的生物分子，最后将此偶联有抗体且封闭完成的金磁微粒 溶解在层析工作液中；所述层析工作液是缓冲液基液加上效应物，其中缓冲液基液为下列任一溶液pH =4-9,0. 005-0. 5M的磷酸盐缓冲液；pH = 6-9,0. 1-3M三羟甲基氨基甲烷-盐酸溶液；pH =3-6,0. 01-3M醋酸盐缓冲液；pH = 6-9,0. 1-10M的硼酸盐缓冲液；pH = 2-5,0. 01-1M甘 氨酸-盐酸缓冲液；效应物是以下的一种或者几种(1)柠檬酸，终浓度为0.1%-5%，(2) 三羟甲基氨基甲烷，终浓度为0.1%-5%，(3)脱脂奶粉，终浓度为0.01%-20%，(4)叠氮 化钠，终浓度为0.01%-5%，(5)分子量4000-20000的聚乙二醇，终浓度为0.01%-5%， (6)Tween20，终浓度为 0. 5-5% ；2)制作免疫层析检测条；该免疫层析检测条包括样品垫，结合垫，免疫层析膜，吸 水纸和支撑板；2. 1)免疫层析检测条的各部件的准备和处理所述样品垫的材质为疏水性或亲水的玻璃纤维或聚酯纤维；样品垫处 理程序为将样品垫浸泡于样品垫处理液中0.5分钟到2分钟后取出，或者按照 0. 5ul/20cm2-20ul/20cm2的比例将样品垫处理液均勻喷涂于样品垫上，然后15°C 60°C烘 干或冷冻干燥，待用；所述样品垫处理液为缓冲液基液加上效应物；所述缓冲液基液为下 列溶液中任一溶液pH = 4-9，0. 005-0. 2M的磷酸盐缓冲液；pH = 6_9，0. 01-3M三羟甲基氨 基甲烷-盐酸溶液；PH = 3-6,0. 01-3M醋酸盐缓冲液；pH = 6-9，0. 1-10M的硼酸盐缓冲液； pH = 2-5，0. 01-1M甘氨酸-盐酸缓冲液；所述效应物是以下的一种或者几种(1)分子量 4000-20000的聚乙二醇，终浓度为0. 01% -5%，(2)蔗糖或者海藻糖，终浓度为5% -80%， (3) Triton X-100，终浓度为0. 5-5% ；所述结合垫的材质为疏水性或亲水的玻璃纤维或聚酯纤维；结合垫处理程序为 首先将玻璃纤维或聚酯纤维裁剪成型；然后将其浸泡于步骤1)所述的最初的层析工作液 中0. 5分钟到2分钟，或者采用非浸泡方式，而是按照0. 5ul/20cm2-20ul/20cm2的比例将样 品垫处理液均勻喷涂于裁剪成型的玻璃纤维或聚酯纤维裁上；然后15°C到60°C烘干或冷 冻干燥；然后取经过步骤1. 4)所得的含有偶联抗体或配体或抗原且封闭金磁微粒的层析 工作液按照0. 5ul/20cm2-20ul/20cm2的比例喷涂于的结合垫上；最后15°C 60°C烘干或冷 冻干燥，待用；所述免疫层析膜的材质为硝酸纤维素膜、尼龙膜、醋酸纤维素膜、聚酯膜，或硝酸 纤维素与醋酸纤维素的混合膜之一；针对偶联抗体或配体或抗原选择的不同，免疫层析膜 的处理程序分别为若检测抗原，则金磁微粒偶联与检测抗原特异结合的抗体，首先取与待检目标物 特异结合的另一抗体，按照0. lul/20cm-20ul/20cm的比例喷涂成线在免疫层析膜上形成 检测带，取多克隆抗体按照0. lul/20cm-20ul/20cm的比例喷涂成本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种金磁微粒标记免疫层析快速检测方法，包括以下步骤：１）金磁微粒标记待检目标物的抗体或者配体或者抗原，并溶解在层析工作液中；１．１）取金磁微粒，用偶联缓冲液平衡３次，然后将待检目标物的抗体或配体或抗原按照与金磁微粒质量比１０～５００μｇ∶１ｍｇ加入经平衡处理后的金磁微粒中，置于０～５０℃、５０～２２０ｒｐｍ的空气恒温振荡器中充分反应１０ｍｉｎ～１２ｈ；所述偶联缓冲液为ｐＨ＝４－９，０．００５－０．５Ｍ的磷酸盐缓冲液、ｐＨ＝３－６，０．１－３Ｍ的三羟甲基氨基甲烷－盐酸溶液或ｐＨ浓度为０．０１％－２０％，（４）叠氮化钠，终浓度为０．０１％－５％，（５）分子量４０００－２００００的聚乙二醇，终浓度为０．０１％－５％，（６）Ｔｗｅｅｎ２０，终浓度为０．５－５％；２）制作免疫层析检测条；该免疫层析检测条包括样品垫，结合垫，免疫层析膜，吸水纸和支撑板；２．１）免疫层析检测条的各部件的准备和处理所述样品垫的材质为疏水性或亲水的玻璃纤维或聚酯纤维；样品垫处理程序为：将样品垫浸泡于样品垫处理液中０．５分钟到２分钟后取出，或者按照０．５ｕｌ／２０ｃｍ↑［２］－２０ｕｌ／２０ｃｍ↑［２］的比例将样品垫处理液均匀喷涂于样品垫上，然后１５℃～６０℃烘干或冷冻干燥，待用；所述样品垫处理液为缓冲液基液加上效应物；所述缓冲液基液为下列溶液中任一溶液：ｐＨ＝４－９，０．００５－０．２Ｍ的磷酸盐缓冲液；ｐＨ＝６－９，０．０１－３Ｍ三羟甲基氨基甲烷－盐酸溶液；ｐＨ＝３－６，０．０１－３Ｍ醋酸盐缓冲液；ｐＨ＝６－９，０．１－１０Ｍ的硼酸盐缓冲液；ｐＨ＝２－５，０．０１－１Ｍ甘氨酸－盐酸缓冲液；所述效应物是以下的一种或者几种：（１）分子量４０００－２００００的聚乙二醇，终浓度为０．０１％－５％，（２）蔗糖或者海藻糖，终浓度为５％－８０％，（３）ＴｒｉｔｏｎＸ－１００，终浓度为：０．５－５％；所述结合垫的材质为疏水性或亲水的玻璃纤维或聚酯纤维；结合垫处理程序为：首先将玻璃纤维或聚酯纤维裁剪成型；然后将其浸泡于步骤１）所述的最初的层析工作液中０．５分钟到２分钟，或者采用非浸泡方式，而是按照０．５ｕｌ／２０ｃｍ↑［２］－２０ｕｌ／２０ｃｍ↑［２］的比例将样品垫处理液均匀喷涂于裁剪成型的玻璃纤维或聚酯纤维裁上；然后１５℃到６０℃烘干或冷冻干燥；然后取经过步骤１．４）所得的含有偶联抗体或配体或抗原且封闭金磁微粒的层析工作液按照０．５ｕｌ／２０ｃｍ↑［２］－２０ｕ...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：崔亚丽，石峰，惠文利，
申请(专利权)人：崔亚丽，
类型：发明
国别省市：87[中国|西安]