【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程，具体涉及一种利用电转和同源重组技术编辑绵羊mstn基因的方法。
技术介绍
1、myostatin(mstn)基因是tgf-β超家族的一员，由3个外显子和2个内含子组成，其编码的无活性前体蛋白由375个氨基酸组成，分为n端信号肽、n端前肽和c端成熟肽。mstn基因主要在骨骼肌中表达，并通过抑制成肌细胞的增殖和分化来调节骨骼肌生长。mstn在哺乳动物中失活及功能或表达量的降低均在某种程度上增强了肌肉发育，尤其在家畜中可表现出显著增加肌肉产量的双肌性状。然而自然发生的能够引起家畜表现双肌表型的mstn变异的频率较低，仅发生在极少品种(系)中，因此利用基因编辑技术可加快mstn变异的频率，是获得优质肉用家畜品种的快捷途径，也是目前研究热点。目前，已报道利用crispr技术获得的mstn基因编辑羊，均为通过显微注射法将编辑材料导入受精卵(胚胎)，实现插入删除(indel)造成移码突变或在编码区引入终止密码子造成mstn蛋白翻译不完整导致功能缺失，获得mstn基因编辑绵羊。mstn不仅在骨骼肌中高表达，而且还在心肌、脂肪、胎盘、乳腺、子宫、嗅觉神经细胞、肝、脾、肺和肾等组织中表达，同样也影响着其它组织和细胞的正常生理功能，完全敲除mstn可能会引起其它未知生理代谢功能障碍。而绵羊mstn基因在特克赛尔羊等肉羊品种中存在3'-utr区(g.6723g＞a，亦称g.6223g＞a或c.2360g＞a)的自然突变形式，不仅能够产生双肌性状，而且也不影响正常生长和生理功能代谢。因此选择该位点基因编辑进行肉羊种质资源创制，可实
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供一种利用电转和同源重组技术编辑绵羊mstn基因的方法，实现绵羊受精卵mstn 3’utr 6723位点的g点突变为a。
2、为了实现上述专利技术目的，本专利技术方案包括以下步骤：
3、将编辑绵羊mstn基因同源重组组分溶解于opti-mem中形成电转材料，将电转材料电转至体外受精时间为4-10h的绵羊受精卵中，电转处理后的受精卵移至胚胎培养液中继续培养；
4、其中，所述编辑绵羊mstn基因同源重组组分包括如seq id no.1所示的mstn-tx-sgrna序列、如seq id no.2所示的mstn-tx-ssodn序列和cas9核酶，电转材料中所述mstn-tx-sgrna终浓度为50-100ng/μl，所述cas9核酶终浓度为100-200ng/μl，所述mstn-ssodn终浓度为50-100ng/μl。
5、优选地，编辑mstn基因同源重组组分还包括m3814，电转材料中所述m3814终浓度为1-2.5μm。
6、进一步优选地，还包括polq sirnamix,所述polq sirnamix包括如seq id no.3所示的shpolq-sirna-493序列；
7、如seq id no.4所示的shpolq-sirna-765a序列；
8、如seq id no.5所示的shpolq-sirna-765b序列；
9、如seq id no.6所示的shpolq-sirna-1395序列；
10、如seq id no.7所示的shpolq-sirna-2459序列；
11、如seq id no.8所示的shpolq-sirna-2531序列；
12、如seq id no.9所示的shpolq-sirna-3977序列；
13、如seq id no.10所示的shpolq-sirna-5457序列；
14、电转材料中所述polq sirnamix终浓度为5μm，其中所述polq sirnamix中各sirna序列浓度相等。
15、优选地，电转所用电极特征为1mm间隙。
16、优选地，电转参数：打孔电压35-40v，时长1-2ms，间隔50ms，脉冲4-5次，衰减率10％，极性“+”；转移电压5-7v，时长50ms，间隔50ms，脉冲4-5次，衰减率40％，极性“+/-”。
17、优选地，每次电转所用的受精卵数量为20-40枚。
18、优选地，原被编辑的绵羊受精卵mstn 3’utr 6723位点不含有a碱基。
19、有益效果，本专利技术提供了一种利用电转和同源重组技术编辑绵羊mstn基因的方法，将编辑绵羊mstn基因3’utr(6723g>a)的sgrna和ssond组合，通过电转受精卵导入编辑材料，经同源重组方式可实现mstn基因3’utr(6723g>a)靶位点g精准突变成为a，使胚胎拥有双肌性状的mstn点突变snp基因型；以电转编辑材料培养7天胚胎裂解物为模板进行pcr预扩增，以预扩增产物为模板，分别进行酶切验证引物pcr扩增和测序pcr引物扩增，酶切引物的扩增产物经酶切和电泳分析，测序引物的扩增产物经hitom测序分析。结果显示，所获得电转胚胎中，发生编辑的胚胎比率高达75％，发生同源重组的胚胎比率在68％以上。本专利技术能够实现高效快速获得绵羊mstn双肌基因型胚胎，在不改变品种其它性状基因构成的基础上，为创制具有双肌性状和高产肉力的绵羊品种(系)提供技术支撑。
20、附图表说明
21、为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。
22、图1为本专利技术流程图。
23、图2为电转组和对照组胚胎pcr扩增acli酶切产物电泳图；其中电转组胚胎pcr产物酶切后为收集电转组16枚囊胚进行pcr预扩增后，acli酶切电泳结果图(此电泳结果与表2测序结果胚胎编号是对应的)；电转组胚胎pcr产物酶切后为收集对照组(未电转)8枚囊胚进行pcr预扩增后，酶切前后acli酶切电泳结果对比图。
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1.一种利用电转和同源重组技术编辑绵羊MSTN基因的方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述利用电转和同源重组技术编辑绵羊MSTN基因的方法，其特征在于，
3.根据权利2所述的利用电转和同源重组技术编辑绵羊MSTN基因的方法，其特征在于，还包括POLQ siRNAMIX,所述POLQ siRNAMIX包括
4.根据权利要求1-3任一权利要求所述的利用电转和同源重组技术编辑绵羊MSTN基因的方法，其特征在于，电转所用电极特征为1mm间隙。
5.根据权利要求4所述的利用电转和同源重组技术编辑绵羊MSTN基因的方法，其特征在于，电转参数：打孔电压35-40V，时长1-2ms，间隔50ms，脉冲4-5次，衰减率10％，极性“+”；转移电压5-7V，时长50ms，间隔50ms，脉冲4-5次，衰减率40％，极性“+/-”。
6.根据权利要求5所述的利用电转和同源重组技术编辑绵羊MSTN基因的方法，其特征在于，每次电转所用的受精卵数量为20-40枚。
7.根据权利要求6所述的利用电转和同源重组技术编辑绵羊M
...【技术特征摘要】
1.一种利用电转和同源重组技术编辑绵羊mstn基因的方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述利用电转和同源重组技术编辑绵羊mstn基因的方法，其特征在于，
3.根据权利2所述的利用电转和同源重组技术编辑绵羊mstn基因的方法，其特征在于，还包括polq sirnamix,所述polq sirnamix包括
4.根据权利要求1-3任一权利要求所述的利用电转和同源重组技术编辑绵羊mstn基因的方法，其特征在于，电转所用电极特征为1mm间隙。
5.根据权利要求4所述的利用电转和同源重...
【专利技术属性】
技术研发人员：吴阳升，马秀玲，汪立芹，陈莹，李亮，林嘉鹏，董红，吴伟伟，薛利，哈尼克孜·吐拉甫，黄俊成，
申请(专利权)人：新疆畜牧科学院生物技术研究所新疆畜牧科学院中国澳大利亚绵羊育种研究中心，
类型：发明
国别省市：
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