【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于细胞培养和细胞分化领域，具体涉及用于nk细胞高效激活和扩增的培养体系、培养试剂盒及培养方法，特别涉及一种高效提升人nk细胞体外扩增和分化效率的方法。
技术介绍
1、自然杀伤(natural killer，nk)细胞是人体天然免疫细胞中的重要组分，由造血干细胞分化而来，作为机体的第一道防线识别并攻击外来病原体和体内肿瘤细胞，是固有免疫系统的重要组成部分。同时，nk细胞与获得性免疫系统的b细胞和t细胞均为淋巴细胞家族成员，其被激活后所释放出的ifnγ能够诱导细胞表面mhc类分子的表达，放大抗原提呈作用，因此nk细胞能作为桥梁连接起固有免疫与获得性免疫两大系统。
2、nk细胞表面不表达特异性抗原识别受体，不受mhc分子的限制，无需预先致敏就能通过多种方式直接杀伤肿瘤细胞，这些方式包括：1.释放穿孔蛋白和颗粒酶素致使肿瘤细胞溶解；2.释放tnf作用于肿瘤细胞表面的tnf受体，致使细胞凋亡；3.nk细胞表面配体(fasl或trail)能与肿瘤细胞表面受体(fas或trailr)结合并诱导其凋亡；4.nk细胞表面的fc受体(cd16，fcriiiγ)能与抗体结合，发挥抗体依赖的细胞毒(adcc)作用。
3、因此，自然杀伤(natural killer，nk)细胞在防御疾病包括恶性肿瘤第一防线中能发挥重要作用。与获得性免疫系统的细胞(例如t细胞)相比，nk细胞无需预先刺激或致敏即可启动细胞毒活性，从而提供即时的自然反应。nk细胞对肿瘤的杀伤优势表现为直接溶解和分泌细胞因子两个方面，其杀伤肿瘤既可通过穿孔素
4、nk细胞可以通过细胞表面tcr和相关的cd3分子的缺失，以及cd56的表达来鉴定。nk细胞主要在血液中循环，约占外周血单个核细胞(pbmc)的5～10％，也存在于骨髓和脾脏等淋巴组织中。
5、在肿瘤治疗中，通过在体外制备对肿瘤具有杀伤功能的nk细胞，然后将nk细胞回输给患者，在患者体内实现对肿瘤细胞的杀伤，从而达到治疗效果。因此，获得足够数量的、杀伤性强、质量稳定的nk细胞，是实现nk细胞肿瘤治疗临床应用的关键。但是，由于来源于外周血的nk细胞难以在体外大量扩增，并且从外周血分离纯化nk细胞存在一定技术难度，例如难以避免来自t淋巴细胞的污染，无法获取大量的、均一的nk细胞并达到临床所需的标准，因此这也成为nk细胞不能广泛应用于临床的障碍；此外，在有些肿瘤患者病例中，nk细胞介导的抗肿瘤反应较弱，这可能与nk细胞杀伤能力差、在体内存活能力差或向肿瘤部位迁移受限等因素有关。
6、nk细胞的体外培养主要包括滋养层细胞法和纯因子培养法。滋养层细胞法是利用人细胞系，经过基因工程改造后与单个核细胞进行共培养，以激活诱导nk细胞。使用白血病细胞系ctv-1在细胞增殖方面作用较小(j.immunol.，178(1)：p85-94,2007)，使用ebv-lcl培养21天后，细胞数量增加了平均约490倍(cytotherapy,11(3):p341-355.2009)，使用表达4-1bbl和膜结合的il-15的滋养细胞k562系，培养nk细胞3周后，nk细胞数量增加了平均227倍数，并在体外和体内呈现高细胞毒性，但是显示出细胞死亡导致的有限的增殖(cancer res.,69(9):p4010-4017,2009)。在用mica、4-1bbl和il-15转染的k562细胞系中培养nk细胞3周后，nk细胞数量增加了平均350倍(tissue antigens,76(6):p467-475,2010)，使用膜结合的il-21转染的k562细胞系培养nk细胞2周同时每隔7天刺激nk细胞时，nk细胞数量增加了平均21000倍。然而，由于使用了所有癌细胞系，因此采用了不适合保证对临床应用非常重要的安全性的方法。此外，由于使用特定的癌细胞作为滋养细胞，因此生产的nk细胞对特定的癌细胞具有启动特异性。
7、纯因子培养法仅需选择不同配比的细胞因子，即可实现nk细胞的激活和扩增，相比之下，操作更加简单便捷。目前市面上在售的nk细胞试剂盒多采用纯因子培养法，广泛使用的因子包括il-2、il-12、il-15、il-18和tnfα等。目前市场上已有的试剂盒大多存在nk细胞增殖速度缓慢、扩增效率较低，或者nk细胞纯度较低(30％～70％)等不足之处。申请人在之前的生产过程中，分别使用过国内多个公司的nk培养试剂盒，结果发现实际培养并未达到其宣传的效果，培养后的cd3-/cd56+细胞比率偏低且差异较大，所以有必要研发更高效的nk细胞培养试剂盒，可提高n细胞的比例和数量，同时降低生产成本、缩短培养时间。
8、因此，寻找活性强的nk细胞及建立体外大规模可供异体使用的培养体系是nk细胞过继免疫治疗肿瘤在临床的应用中亟需解决的问题。建立易于操作、质量可控、产量高、产物活性高、成本低的nk细胞系大规模连续培养及制备工艺可解决细胞免疫治疗技术所面临的瓶颈难题，使细胞治疗产品有可能像药物一样批量化、规模化、均一化、流程化生产。
技术实现思路
1、鉴于现有技术中存在的问题，例如，使用滋养细胞培养的nk细胞在临床应用方面存在安全性隐患；但无滋养细胞的培养法其有效扩增倍数低或操作复杂，本专利技术提供了用于nk细胞高效激活和扩增的培养体系、培养试剂盒及培养方法，旨在提供能够从pbmc直接扩增培养的采用细胞因子刺激的无滋养细胞扩增体系，具有重要应用前景。
2、本专利技术由如下技术方案实现的：一种自然杀伤细胞培养体系，包括至少一种包被刺激物、至少一种诱导培养基和至少一种扩增培养基。
3、进一步的，所述诱导培养基以rpmi 1640为基础培养基，包含以下浓度的组分：体积浓度为10％的fbs、100×glutamaxtm添加剂、50iu/ml～300iu/ml的il-2、5ng/ml～30ng/ml的il-15和0.5μg/ml～5μg/ml的ok432、5ng/ml～20ng/ml的il-12和10ng/ml～100ng/ml的il-18；
4、所述扩增培养基以rpmi 1640为基础培养基，包含以下浓度的组分：体积浓度为10％的fbs、100×glutamaxtm添加剂、200iu/ml～1000iu/ml的il-2和10ng/ml～50ng/ml的il-15。
5、优选的，所述诱导培养基中il-2的浓度为80iu/ml～150iu/ml，il-15的浓度为8ng/ml～15ng/ml，ok432的浓度为0.8μg/ml～2.0μg/ml，il-12的浓度为8ng/ml～15ng/ml，il-18的浓度为40ng/ml～70ng/ml；
6、所述扩增本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种自然杀伤细胞培养体系，包括至少一种包被刺激物、至少一种诱导培养基和至少一种扩增培养基。
2.根据权利要求1所述的自然杀伤细胞培养体系，其特征在于：所述诱导培养基以RPMI1640为基础培养基，包含以下浓度的组分：体积浓度为10％的FBS、100×GlutaMAXTM添加剂、50IU/mL～300IU/mL的IL-2、5ng/mL～30ng/mL的IL-15和0.5μg/mL～5μg/mL的OK432、5ng/mL～20ng/mL的IL-12和10ng/mL～100ng/mL的IL-18；
3.根据权利要求2所述的自然杀伤细胞培养体系，其特征在于：所述诱导培养基中IL-2的浓度为80IU/mL～150IU/mL，IL-15的浓度为8ng/mL～15ng/mL，OK432的浓度为0.8μg/mL～2.0μg/mL，IL-12的浓度为8ng/mL-15ng/mL，IL-18的浓度为40ng/mL～70ng/mL；
4.根据权利要求1所述的自然杀伤细胞培养体系，其特征在于：所述包被刺激物包含MICA、anti-CD16抗体和Anti-CD137
5.一种自然杀伤细胞培养试剂盒，其特征在于：包括至少一种包被刺激物、至少一种诱导培养基和至少一种扩增培养基。
6.根据权利要求5所述的自然杀伤细胞培养试剂盒，其特征在于：所述诱导培养基以RPMI 1640为基础培养基，包含以下浓度的组分：体积浓度为10％的FBS、100×GlutaMAXTM添加剂、50IU/mL～300IU/mL的IL-2、5ng/mL～30ng/mL的IL-15和0.5μg/mL～5μg/mL的OK432、5ng/mL～20ng/mL的IL-12和10ng/mL～100ng/mL的IL-18；
7.根据权利要求6所述的自然杀伤细胞培养试剂盒，其特征在于：所述诱导培养基中IL-2的浓度为80IU/mL～150IU/mL，IL-15的浓度为8ng/mL～15ng/mL，OK432的浓度为0.8μg/mL～2.0μg/mL，IL-12的浓度为8ng/mL～15ng/mL，IL-18的浓度为40ng/mL～70ng/mL；
8.根据权利要求5所述的自然杀伤细胞培养试剂盒，其特征在于：所述包被刺激物包含MICA、anti-CD16抗体和Anti-CD137抗体；其中：所述MICA的浓度为1μg/mL～5μg/mL，Anti-CD16抗体的浓度为1μg/mL～5μg/mL，Anti-CD137抗体的浓度范围为1μg/mL～20μg/mL。
9.一种自然杀伤细胞培养方法，其特征在于：包括以下步骤：
10.根据权利要求9所述的自然杀伤细胞培养方法，利用权利要求1-4中任一所述自然杀伤细胞培养体系和/或权利要求5～8任一所述的培养试剂盒进行培养。
...【技术特征摘要】
1.一种自然杀伤细胞培养体系，包括至少一种包被刺激物、至少一种诱导培养基和至少一种扩增培养基。
2.根据权利要求1所述的自然杀伤细胞培养体系，其特征在于：所述诱导培养基以rpmi1640为基础培养基，包含以下浓度的组分：体积浓度为10％的fbs、100×glutamaxtm添加剂、50iu/ml～300iu/ml的il-2、5ng/ml～30ng/ml的il-15和0.5μg/ml～5μg/ml的ok432、5ng/ml～20ng/ml的il-12和10ng/ml～100ng/ml的il-18；
3.根据权利要求2所述的自然杀伤细胞培养体系，其特征在于：所述诱导培养基中il-2的浓度为80iu/ml～150iu/ml，il-15的浓度为8ng/ml～15ng/ml，ok432的浓度为0.8μg/ml～2.0μg/ml，il-12的浓度为8ng/ml-15ng/ml，il-18的浓度为40ng/ml～70ng/ml；
4.根据权利要求1所述的自然杀伤细胞培养体系，其特征在于：所述包被刺激物包含mica、anti-cd16抗体和anti-cd137抗体；其中：所述mica的浓度为1μg/ml～5μg/ml，anti-cd16抗体的浓度为1μg/ml～15μg/ml，anti-cd137抗体的浓度范围为1μg/ml～20μg/ml。
5.一种自然杀伤细胞培养试剂盒，其特征在于：包括至少一种包被刺激物、至少一种诱导培养基和至少一种扩增培养基。
<...【专利技术属性】
技术研发人员：卢社莲，李燕荣，李营营，
申请(专利权)人：北京鼎成肽源生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：
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