【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物技术检测，特别是涉及一种定量蒿属植物花粉中art an1类防御蛋白过敏原的方法。
技术介绍
1、蒿属植物花粉是造成夏秋季节过敏性疾病的主要致敏原之一，据统计，在北方地区尤为严重(超过50％)。我国蒿属植物分布广泛，种类繁多，其中黄花蒿(artemisiaannua)、艾蒿(a.argyi)、大籽蒿(a.sieversiana)、茵陈蒿(a.capillaris)、野艾蒿(a.lavandulifolia)等最为常见，目前用于体外诊断和免疫治疗的花粉提取物主要来自大籽蒿和黄花蒿。
2、国际免疫学会联合会(iuis)下属的过敏原命名专门委员会(allergennomenclature sub-committee)(http：//www.allergen.org)数据库中已经收录的蒿花粉过敏原共12种，按照过敏原命名规则，依次命名为art v 1-6(来源于北艾a.vulgaris)以及来源于黄花蒿(a.annua)的art an 7、art an 14以及来自大籽蒿的art si 8和art sil2。其中第一组分(art v 1)，第三组分(art v 3)和第七组分(art an 7)是主要过敏原。art v1属于类防御蛋白，被视为蒿花粉过敏的标志过敏原，超过80％的蒿过敏患者对其敏感，成熟art v 1蛋白包含108个氨基酸，理论等电点8.17，由n端的富含半胱氨酸的防御素结构域和c端富含脯氨酸的区域组成，c端包含羟基化和o-糖基化修饰，因此天然过敏原分子量约为24-28kda。该过敏原在不同蒿属
3、目前用于临床诊断和脱敏治疗的制剂主要是花粉提取物，而这些提取物由于种类和批次不同，其中所包含的过敏原有效成分差异很大，有些重要的过敏原在提取物中含量很低，用于诊疗中常出现漏检或脱敏治疗效果不显著等问题，因此，为了提高临床诊疗效率，对提取物中的主要过敏原进行定量是非常重要的。用于过敏原定量的方法包括酶联免疫吸附法(elisa)，质谱以及其他的分子生物学手段如pcr等，其中双夹心酶联免疫吸附实验是最常用的过敏原定量方法，尤其在检测微量过敏原方面有很高的应用价值。
技术实现思路
1、本专利技术提供一种用于蒿花粉中art an 1类型过敏原定量的方法，该方法具有较高的灵敏性和特异性，能够定量常见蒿属花粉中art an 1类型过敏原。
2、利用单抗-多抗夹心酶联免疫吸附实验对我国主要的蒿属花粉提取物(黄花蒿、艾蒿、茵陈蒿、大籽蒿、野艾蒿、细裂叶莲蒿(a.gmelinii))中的art an 1类型过敏原进行定量。
3、本专利技术包含以黄花蒿花粉提取物免疫小鼠，生产并筛选蒿花粉art an1类型过敏原的特异性单克隆抗体a7g4e6，对单抗的亚型和效价进行检测；以重组的art an 1过敏原免疫兔子生产多克隆抗体789。然后以a7g4e6作为包被抗体，789多抗作为检测抗体，构建双夹心酶联免疫吸附定量检测体系。单抗和多抗都来源于杭州艾乐吉生物科技有限公司，其中a7g4e6单抗的货号为ma-a7g4e6，789多抗的货号为pa-789。
4、本专利技术提供了6种我国常见蒿属花粉中art an 1类型过敏原的氨基酸序列，每种花粉中各鉴定到1-2种不同亚型，依据iuis的过敏原命名规则进行命名。
5、本专利技术包含用单克隆抗体(a7g4e6)纯化黄花蒿花粉提取物中的art an 1类型过敏原，通过电泳(sds-page)和质谱(lc-ms/ms)对纯化产物进行鉴定，以bca法测定纯化出的过敏原浓度，并将其用作标准品对不同蒿花粉提取物中的art an 1类型过敏原进行定量。
6、本专利技术包含在大肠杆菌表达黄花蒿花粉中的类防御蛋白过敏原天然art an 1并进行纯化，通过电泳(sds-page)和质谱(lc-ms/ms)对纯化产物进行鉴定，用于多克隆抗体的生产。
7、一种定量蒿属植物花粉中类防御蛋白过敏原的方法，使用单抗-多抗夹心酶联免疫吸附实验进行定量，其中一抗为a7g4e6单抗，来自杭州艾乐吉生物科技有限公司，货号ma-a7g4e6；二抗为789多抗，来自杭州艾乐吉生物科技有限公司，货号pa-789。
8、优选的，二抗用生物素标记。进一步优选的，使用hrp结合二抗后再加tmb避光显色后进行吸光值检测。进一步优选的，使用蒿属植物对应的art an 1过敏原标准品进行检测得到吸光值后绘制标准曲线，将待检测的蒿属植物花粉样品检测得到的吸光值代入标准曲线计算得到相应浓度。进一步优选的，蒿属植物使用art an 1过敏原标准品。该定量检测方法的最低检测阈值为0.25ng/ml，最佳浓度测定范围为0.5-16ng/ml。
9、优选的，蒿属植物为黄花蒿、艾蒿、茵陈蒿、细裂叶莲蒿、大籽蒿、野艾蒿或北艾。
10、本专利技术一种定量蒿属植物花粉中类防御蛋白过敏原的方法具有较高的灵敏性和特异性，能够定量常见蒿属花粉中art an 1类型过敏原。
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1.一种定量蒿属植物花粉中Art an 1类防御蛋白过敏原的方法，其特征在于，使用单抗-多抗夹心酶联免疫吸附实验进行定量，其中一抗为A7G4E6单抗，来自杭州艾乐吉生物科技有限公司，货号MA-A7G4E6；二抗为789多抗，来自杭州艾乐吉生物科技有限公司，货号PA-789。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，二抗用生物素标记。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，使用HRP结合二抗后再加TMB避光显色后进行吸光值检测。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，使用蒿属植物对应的Art an 1过敏原标准品进行检测得到吸光值后绘制标准曲线，将待检测的蒿属植物花粉样品检测得到的吸光值代入标准曲线计算得到相应浓度。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，蒿属植物使用Art an 1过敏原标准品。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，Art an 1过敏原标准品的最低检测阈值为0.25ng/ml，最佳浓度测定范围为0.5-16ng/ml。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，蒿属植物为黄花蒿、艾蒿
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，一抗和二抗的使用浓度均为3μg/ml。
...【技术特征摘要】
1.一种定量蒿属植物花粉中art an 1类防御蛋白过敏原的方法，其特征在于，使用单抗-多抗夹心酶联免疫吸附实验进行定量，其中一抗为a7g4e6单抗，来自杭州艾乐吉生物科技有限公司，货号ma-a7g4e6；二抗为789多抗，来自杭州艾乐吉生物科技有限公司，货号pa-789。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，二抗用生物素标记。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，使用hrp结合二抗后再加tmb避光显色后进行吸光值检测。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，使用蒿属植物对应的art an 1过敏原标准品进行检测得...
【专利技术属性】
技术研发人员：高中山，赵岚，高毕远，
申请(专利权)人：杭州艾乐吉生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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