【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及分子检测领域，尤其是涉及一种基于dnase i/apt/rgo联合多通道微流控芯片检测方法与应用。
技术介绍
1、肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，hcc)是世界上最常见的恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率在过去10年呈上升趋势。hcc的早期诊断有非侵入性的影像学成像方法、侵入性的穿刺活检和病理学检测和afp等血清学肿瘤标志物的检测方法。目前，组织活检和病理学检查是诊断hcc的金标准，虽然该方法准确度高，但因具有创伤性，患者不容易接受。影像学成像方法则需要大型仪器，所以在资源缺乏的地区难以普及。液体活检相对传统的肿瘤组织检测技术，具有无创性检查，操作方便，标本易得等优点，已成为肿瘤检测的一颗新星，应用于肿瘤的早期诊断。
2、相关技术中，血清甲胎蛋白afp是目前最常用的肝癌筛查和诊断的血清肿瘤标志物，已在临床广泛应用。然而，由于监测工具的敏感性和特异性不足，使得大多数肝癌患者未能在早期阶段被发现，这突显了需要更准确的生物标志物来改善肝癌的早期诊断。目前，已经发展了很多种肝癌生物标志物的检测方法，例如酶联免疫分析法、电化学法、荧光法、表面增强拉曼光谱法、pcr、环介导等温扩增等方，然而，这些方法存在灵敏性低，且仅能检测单一的蛋白类生物标志物或核酸类生物标志物，无法实现蛋白与核酸生物标志物同时检测。
3、因此，亟需建立一种高特异性、高灵敏度的检测方法，为hcc患者的临床诊断提供准确的判断依据，尽早进行治疗，提高病患生存率。
技术实现思路p>
1、本专利技术旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本专利技术提出一种基于dnase i/apt/rgo联合多通道微流控芯片检测方法，该检测方法是基于双信号放大策略，能够同时检测待测样品中的多个目标物质含量，其对蛋白类目标物质的检测限能够达到4.5pg/ml，对于核酸类目标物质的检测限能够达到1.3fm，可用于血清低浓度标志物的检测。
2、本专利技术还提出一种上述基于dnase i/apt/rgo联合多通道微流控芯片的检测方法在检测生物标志物中的应用。
3、本专利技术的第一方面，提供了一种基于dnase i/apt/rgo联合多通道微流控芯片检测方法，包括以下步骤：
4、s1、将待测样品加入含荧光基团的核酸适配子和终浓度为15～30μg/ml生物还原氧化石墨烯的缓冲液中孵育，然后加入终浓度为5～40u/ml的脱氧核糖核酸酶反应，离心，收集上清液；
5、s2、采用微流控芯片对所述上清液进行检测，然后根据荧光信号强度定量所述待测样品中目标检测物的浓度；
6、所述检测方法用于非疾病诊断目的。
7、根据本专利技术实施例的检测方法，至少具有如下有益效果：
8、(1)本专利技术方法基于双信号放大策略开发了一种基于dnase i/apt/rgo联合多通微流控富集芯片的高效检测方法，其能够同时检测多种生物标志物，且同一块芯片上同时检测蛋白和核酸仅需要30分钟。此外，以肝细胞癌生物标志物检测为例，采用本专利技术的检测方法，afp、cea和mir-21的检出限(lod)分别达到37.0pg/ml、4.5pg/ml和1.3fm，可以满足hcc患者血清低浓度标志物的检测。
9、(2)本专利技术的检测方法中采用了还原氧化石墨烯，通常认为氧化石墨烯(go)是一种理想的生物相容性纳米材料，具有极强的距离依赖性荧光淬灭能力。go通过π-π电子堆积相互作用吸附单链dna(ssdna)，不仅可淬灭fam标记dna的荧光，而且可以保护其表面吸附的单链dna的稳定性，阻止酶切。但是相比go，还原氧化石墨烯(rgo)具有更好淬灭单链荧光dna的特性。
10、在本专利技术的一些实施方式中，所述待测样品包括全血或血清。
11、在本专利技术的一些实施方式中，所述核酸适配子包括用于检测蛋白的核酸适配子和/或用于检测核酸的核酸适配子。
12、核酸适配子(apt)是一类新型识别分子，是应用新型组合化学技术-指数富集配基的系统进化技术(selex)体外筛选得到的一类寡聚dna或rna分子，apt具有特殊而稳定的三维结构，可以通过空间构型与不同的靶分子之间高亲和力、高特异性结合，这种结合方式与抗体和抗原结合类似，是一种特殊的“化学抗体”。与传统的蛋白质抗体相比，apt具有亲和力高、特异性强、筛选条件灵活、靶标范围广、成本低、分子量小、易合成与修饰、低免疫原性及稳定性好等诸多优势。
13、相关及时中，尽管基于apt、dnase i和纳米材料对靶点的循环识别极大地提高了检测灵敏度，但仍难以满足全血中超低浓度蛋白质和mirna的检测。而本专利技术通过合理搭配和优化实现了全血中超低浓度蛋白质和mirna的检测。
14、在本专利技术的一些实施方式中，所述核酸适配子包括apt-cea、apt-afp和apt-mir21中的至少一种。
15、血清甲胎蛋白(afp)是目前公认的hcc生物标志物，30-40％的hcc患者有低丰度的afp，导致对hcc的早期诊断不敏感和非特异性；癌胚抗原(cea)是一种广谱肿瘤标志物，在多种恶性肿瘤血清中升高。cea虽然不能作为诊断某种恶性肿瘤的特异性指标，但在恶性肿瘤的鉴别诊断、病情监测、疗效评价等方面，仍有重要临床价；micro-rna(mirna)是一类含18-23个核苷酸的非编码rna，在肿瘤发生、转移中发挥着重要作用，是一种预测、诊断和监测癌症治疗的新生物标志物。采用本专利技术基于dnase i/apt/rgo联合多通道微流控芯片检测方法能够同时检测血清中的afp、cea和mir 21，可为hcc患者的临床诊断提供准确的判断依据，实现尽早治疗，提高病患生存率。
16、在本专利技术的一些实施方式中，所述apt-cea的核苷酸序列信息如seq id no.1所示。
17、在本专利技术的一些实施方式中，所述apt-afp的核苷酸序列信息如seq id no.2所示。
18、在本专利技术的一些实施方式中，所述apt-mir 21的核苷酸序列信息如seq id no.3所示。
19、在本专利技术的一些实施方式中，所述荧光基团选自fam、hex、cy5中的一种。优选地，所述荧光基团为fam。
20、在本专利技术的一些实施方式中，所述荧光基团位于所述核酸适配子的5’端。
21、在本专利技术的一些实施方式中，所述含荧光基团的核酸适配子的浓度为5～50nm。
22、在本专利技术的一些优选的实施方式中，所述含荧光基团的核酸适配子的浓度为5～30nm。
23、在本专利技术的一些更优选的实施方式中，所述含荧光基团的核酸适配子的浓度为5～15nm。
24、在本专利技术的一些实施方式中，所述缓冲液中还包含15～25mm tris、80～120mmnacl、3～8mm mgcl2和0.5～1.5mm cacl2。
25、在本专利技术的一些实施方式中，所述脱氧核糖核酸酶包括脱氧核糖核酸酶i本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种基于DNase I/Apt/rGO联合多通道微流控芯片检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述核酸适配子包括用于检测蛋白的核酸适配子和/或用于检测核酸的核酸适配子；
3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述含荧光基团的核酸适配子的浓度为5～50nM。
4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述缓冲液中还包含15～25mM Tris、80～120mM NaCl、3～8mM MgCl2和0.5～1.5mM CaCl2。
5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述脱氧核糖核酸酶包括脱氧核糖核酸酶I。
6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述孵育的时间为10～30min；
7.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述微流控芯片包含1～4条平行微通道；
8.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述采用微流控芯片对所述上清液进行检测具体包括：首先用牛血清白蛋白修饰所述微流控芯片微通道，然后在含CH3CN的P
9.如权利要求1～8中任一项所述的基于DNase I/Apt/rGO联合多通道微流控芯片的检测方法在检测生物标志物中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述生物标志物包括肝癌生物标志物。
...【技术特征摘要】
1.一种基于dnase i/apt/rgo联合多通道微流控芯片检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述核酸适配子包括用于检测蛋白的核酸适配子和/或用于检测核酸的核酸适配子；
3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述含荧光基团的核酸适配子的浓度为5～50nm。
4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述缓冲液中还包含15～25mm tris、80～120mm nacl、3～8mm mgcl2和0.5～1.5mm cacl2。
5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述脱氧核糖核酸酶包括脱氧核糖核酸...
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