一种抗虫基因ＯｓＲＧ１及其编码产物与应用制造技术

本发明专利技术公开了一种抗虫相关基因ＯｓＲＧ１其及其编码产物与应用，该抗虫基因ＯｓＲＧ１具有ＳＥＱ?ＩＤ?Ｎｏ．１的ＤＮＡ序列。该序列由７６３个核苷酸碱基组成，包含一个由６２４个核苷酸构成的完整的编码框，编码２０８个氨基酸残基的小分子量蛋白。研究发现ＯｓＲＧ１与水稻的抗虫相关，该基因的表达产物能对褐飞虱起很好的趋避和抗生作用。本发明专利技术将在作物育种，特别是在水稻抗虫育种中得到广泛应用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物
，特别地，涉及一种抗虫基因OsRGl及其编码产物与应用。
技术介绍
随着全球人口的增加和耕地面积的减少，人们对粮食单产的要求越来越高。虫害 造成的粮食损失一般约占粮食总产量的10-30%，重灾年份则颗粒无收，因此如何减少虫害 以增加粮食总产量，是人们面临的迫切问题。培育抗性品种是减少害虫危害的一个重要措 施。稻飞虱属于同翅目飞虱科，主要包括褐飞虱Nilaparvata lugens (StAl)、白背飞 虱Sogatella furcifera等，是我国水稻上的最重要害虫之一。近几年来，则为稻飞虱主要 种类之一的褐飞虱，更是年年大暴发，对我国水稻粮食生产造成了严重危害。据浙江省农业 厅调查统计，2005年浙江省第5代褐飞虱发生量每667m2达30万头以上的有66. 7万hm2， 占水稻总种植面积的86% ；每667m2在100万头以上的有33. 3万hm2，占42% ；最高田块的 发生量达到每667m21000万头以上；绝收的面积达5333hm2，造成直接水稻产量损失120万 吨。造成褐飞虱近几年来特大爆发的一个重要原因，是目前生产上缺乏抗稻飞虱的水稻品 种。因此，发掘抗稻飞虱基因，培育抗稻飞虱品种，将是控制稻飞虱危害的一个重要方面。至今，国内外已在水稻抗稻飞虱基因鉴定与定位等方面取得了很大成绩。至今已 命名了 13个抗褐飞虱的主基因，并对其中的8个进行了染色体定位；此外，也鉴定和定位了 10多个抗褐飞虱的数量形状基因座(QTL)。对抗白背飞虱的主基因已命名了 6个，并对其 中的2个进行了定位；同时，也有10多个抗白背飞虱的数量形状基因座被鉴定和定位。然 而，至今为止，国内外尚没有克隆到水稻的抗稻飞虱基因。
技术实现思路
本专利技术的目的在于针对现有技术的不足，提供一种抗虫基因OsRGl及其编码产物与应用。本专利技术的目的是通过以下技术方案来实现的一种抗虫基因OsRGl，它具有SEQ ID No. 1的DNA序列。一种权利要求1所述抗虫基因OsRGl的编码蛋白，它包含SEQ ID No. 2的氨基酸 序列的蛋白质，或者是将SEQ ID No. 2的氨基酸残基序列经过一个或多个氨基酸残基的取 代、缺失或者添加且具有与SEQ ID No. 2的氨基酸残基序列相同活性的由SEQ ID No. 2衍 生的蛋白质。一种权利要求1所述抗虫基因OsRGl在转基因植物中的应用。一种权利要求1所述抗虫基因OsRGl在作物育种中的应用。本专利技术的有益效果是，本专利技术利用SSH方法和基因芯片技术分析了水稻在害虫为 害后的差异表达基因，结合RT-PCR和RACE技术分离获得了 OsRGl基因；以OsRGl基因片段合成同位素探针，应用Northern杂交方法分析了 OsRGl基因在飞虱为害后的表达情况；利 用转基因技术验证了 OsRGl基因的生物学功能，发现OsRGl基因在水稻对稻飞虱的抗性中 发挥着重要作用。该基因的分离克隆，对于作物的抗虫育种，尤其对水稻的抗稻飞虱育种将 起到重要的促进作用。附图说明图1是OsRGl基因特异PCR扩增产物凝胶电泳图；图2是pMD-19-OsRGl酶切鉴定凝胶电泳图；图3是水稻受稻飞虱为害后OsRGl基因的表达情况电泳图；图4是OsRGl基因的结构示意图；图5是含OsRGl基因的水稻遗传转化质粒T-DNA框结构示意图；图6是OsRGl基因表达减少稻飞虱的产卵量；图7是OsRGl基因表达明显增强对稻飞虱的抗性。具体实施例方式本专利技术利用差减杂交技术SSH，结合基因芯片检测技术，分析了水稻在害虫为害后 所诱导的差异表达基因。从SSH克隆库中分析获得OsRGl基因片段，以此片段设计正向和 反向引物，分别进行3，-RACE和5，-RACE RP-PCR获得了该基因的5，端和3，端基因PCR 片段，并直接测序拼接。根据基因测序拼接获得DNA序列，在5’端和3’端非编码区重新设 计一对引物OsRGl-Fl和OsRGl-Rl，提取害虫为害的水稻叶片mRNA并反转录成cDNA，以此 cDNA为模板并以OsRGl-FA和OsRGl-Rl为引物进行常规PCR反应，获得OsRGl全基因序列 并连接到PMD-T克隆载体测序验证。Northern杂交结果证明OsRGl在害虫早期就开始诱导 表达，并且持续相当长的时间，证明OsRGl基因在水稻种起重要作用。通过获得含OsRGl基 因的水稻转基因突变体，通过生物测定，证明了 OsRGl是一个重要抗飞虱基因。对该基因的 分离和克隆以及生物学功能的分析，对于作物的抗虫育种，尤其对水稻的抗稻飞虱育种将 起到重要的促进作用。实现本专利技术的具体技术步骤如下LOsRGl基因的分离和序列分析利用基因芯片技术和SSH技术分析了水稻在害虫为害后的差异表达基因，获得害 虫为害诱导的特异表达基因克隆库，并筛选到单克隆LYG22。测序分析发现此克隆并没有覆 盖该基因的完整编码区。为了获得该片段的完整编码区序列，我们用3’_RACE和5’-RACE技术扩增该片段 的3’末端和5’末端片段。根据TaKaRa Race试剂盒方法，以害虫为害水稻叶片mRNA为 模板合成cDNA双链。以该片段正向引物Fl与3’ RACE锚定引物P3配对，反向引物Rl与 5，RACE锚定引物P5配对作常规PCR分别获得5，RACE PCR片段和3，RACE PCR片段，PCR 片段经PCR片段回收试剂盒纯化后，测序得到LYG22的5’末端和3’末端序列信息。以LYG22的5’末端和3’末端序列信息在5’端和3’端非编码区重新设计一对引 物OsRGl-Fl和OsRGl-Rl，并以上面合成的cDNA双链为模板，PCR扩增后连接入pMD_19T克 隆载体，挑取4个克隆送上海生物工程公司测序，每个分别测通2次。测序结果，用生物信4息专业DNA拼接软件Conting 3.1拼接。获得OsRGl基因DNA序列，见序列表SEQ ID No. 1 表示的序列。根据该序列的开放阅读框(ORF)，推算出该基因编码蛋白的氨基酸序列，如SEQ ID No. 2 所示。2. OsRGl基因在害虫为害后的表达谱分析取水稻经飞虱为害0，1. 5，3，6，12，24，48，72h的茎杆，用Trizol法提取其总RNA, 分别将10 μ g各时间点RNA经甲醛电泳分离后，通过毛细管上吸的方法转到尼龙膜 上，经紫外交联固定RNA在膜上。以OsRGl基因片段合成同位素探针，对膜进行杂交分析。 Northern杂交结果证明OsRGl在害虫为害早期就开始诱导表达，并且持续相当长的时间 (图 3)。3.构建含OsRGl基因水稻遗传转化载体(图5)。构建的表达载体以电击法转化 农杆菌，获得含有表达载体的工程农杆菌，以本实验成熟的农杆菌转基因方法侵染水稻愈 伤，愈伤经抗性筛选后获得整合了目的基因的愈伤组织，再经分化培养基和生根培养基中 培养，获得含OsRGl基因转基因水稻。对水稻植株进行观察未发现植株生理缺陷，能获得正 常世代。生物测定试验表明，稻飞虱成虫含OsRGl基因水稻上的产卵量明显减少，如图6A 和B。稻飞虱抗性实验表明含OsRGl基因水稻长势明显优于对照水稻，接稻飞虱在16天后 对照水稻基本枯死，而含OsRGl基因水稻水稻仅外面的叶片枯黄(图7本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种抗虫基因ＯｓＲＧ１，其特征在于，它具有ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ．１的ＤＮＡ序列。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：娄永根，周国鑫，齐金峰，任楠，毛碧增，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：86[中国|杭州]