【技术实现步骤摘要】
本申请涉及基因载体构建的，更具体地说，涉及一种靶向rb1的重组腺相关病毒载体及其构建方法和应用。
技术介绍
1、视网膜母细胞瘤(rb)是一种起源于胚胎视网膜细胞的眼内恶性肿瘤，遗传方式为常染色体显性遗传，常见于儿童期，多在4岁以前发病，临床表现为早期眼底出现灰白色肿块，肿块在眼内生长时外眼正常，故很难发现。rb1基因突变是rb最重要的遗传学致病驱动畸变，rb1基因突变导致的功能缺失也是rb发生的最主要原因。因此，针对rb1基因开展基因治疗是攻克rb的根本途径。
2、然而，目前已发现的rb特异性rb1基因突变超过3000种，rb1基因突变的类型和突变的位点多变，无热点突变，故难以通过修复特定位点进行治疗。且rb1基因片段较大，缺乏安全有效地递送rb1基因的载体系统，导致rb1基因治疗难以实施。上述问题严重阻碍了rb的靶向治疗研究。
技术实现思路
1、本申请提供一种靶向rb1的重组腺相关病毒载体及其构建方法和应用。为了进一步推动rb的靶向治疗研究，本申请成功构建了高效、精准靶向视网膜母细胞的重组腺相关病毒(raav2-rb1)，可高效回补重建rb1基因的功能。在此基础上，本申请以rb的pdx动物模型开展干预试验，验证本申请提供的重组腺相关病毒对rb的有效性和安全性，以期为靶向rb1基因治疗rb建立可靠方案。
2、第一方面，本申请提供一种靶向rb1的重组腺相关病毒载体，采用如下的技术方案：
3、一种靶向rb1的重组腺相关病毒载体，所述载体的表达框架包括
4、可选地，所述rb1基因的核苷酸序列包含如seq id no 1-seq id no 3所示的核苷酸序列。
5、在一个具体的实施方式中，所述rb1基因的核苷酸序列包含如seq id no 1所示的核苷酸序列。
6、在一个具体的实施方式中，所述rb1基因的核苷酸序列包含如seq id no 2所示的核苷酸序列。
7、在一个具体的实施方式中，所述rb1基因的核苷酸序列包含如seq id no 3所示的核苷酸序列。
8、可选地，所述aav2的cap基因的核苷酸序列包含如seq id no 4-seq id no 6所示的核苷酸序列。
9、在一个具体的实施方式中，所述aav2的cap基因的核苷酸序列包含如seq id no 4所示的核苷酸序列。
10、在一个具体的实施方式中，所述aav2的cap基因的核苷酸序列包含如seq id no 5所示的核苷酸序列。
11、在一个具体的实施方式中，所述aav2的cap基因的核苷酸序列包含如seq id no 6所示的核苷酸序列。
12、可选地，所述aav2的rep基因的核苷酸序列包含如seq id no 7-seq id no 9所示的核苷酸序列。
13、在一个具体的实施方式中，所述aav2的rep基因的核苷酸序列包含如seq id no 7所示的核苷酸序列。
14、在一个具体的实施方式中，所述aav2的rep基因的核苷酸序列包含如seq id no 8所示的核苷酸序列。
15、在一个具体的实施方式中，所述aav2的rep基因的核苷酸序列包含如seq id no 9所示的核苷酸序列。
16、可选地，所述rb1基因、所述aav2的cap基因、所述aav2的rep基因的顺序为cap-rep-rb1、rep-rb1-cap、rep-cap-rb1、cap-rb1-rep、rb1-cap-rep、rb1-rep-cap。
17、在一个具体的实施方式中，所述rb1基因、所述aav2的cap基因、所述aav2的rep基因的顺序为cap-rep-rb1。
18、在一个具体的实施方式中，所述rb1基因、所述aav2的cap基因、所述aav2的rep基因的顺序为rep-rb1-cap。
19、在一个具体的实施方式中，所述rb1基因、所述aav2的cap基因、所述aav2的rep基因的顺序为rep-cap-rb1。
20、在一个具体的实施方式中，所述rb1基因、所述aav2的cap基因、所述aav2的rep基因的顺序为cap-rb1-rep。
21、在一个具体的实施方式中，所述rb1基因、所述aav2的cap基因、所述aav2的rep基因的顺序为rb1-cap-rep。
22、在一个具体的实施方式中，所述rb1基因、所述aav2的cap基因、所述aav2的rep基因的顺序为rb1-rep-cap。
23、第二方面，本申请提供一种靶向rb1的重组腺相关病毒载体的构建方法，其特征在于，所述构建方法具体包括以下步骤：
24、利用酶切载体使载体线性化，同时设计引物从模板中调取目的片段、扩增并胶回收目的片段，将胶回收的目的片段与线性化的载体连接重组并转化dh5α感受态细胞。通过pcr鉴定阳性克隆，摇菌抽提质粒后测序，最终构建含有目的片段的载体质粒。
25、第三方面，本申请提供一种靶向rb1的重组腺相关病毒载体在制备用于基因治疗视网膜母细胞瘤的组合物中的应用。
26、为了进一步推动rb的靶向治疗研究，本申请成功构建了高效、精准靶向视网膜母细胞的重组腺相关病毒(raav2-rb1)，可回补重建rb1基因的功能。在此基础上，本申请以rb的pdx动物模型开展干预试验，验证本申请提供的载体对rb的有效性和安全性，以期为靶向rb1基因治疗rb建立可靠方案。
27、综上所述，本申请具有以下有益效果：
28、1.本申请提供的靶向rb1的重组腺相关病毒(raav2-rb1)，能够为rb的治疗提供新的方向，提高rb治疗的有效性，降低眼球摘除率。
29、2.经过试验分析可知，在rb的pdx动物模型中注射raav2-rb1可显著抑制视网膜母细胞瘤的生长，并在小鼠体内具有良好的生物安全性。
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1.一种靶向RB1的重组腺相关病毒载体，其特征在于，所述载体的表达框架包括：AAV2的Cap基因、AAV2的Rep基因、RB1基因。
2.根据权利要求1所述的重组腺相关病毒载体，其特征在于，所述RB1基因的核苷酸序列包含如SEQ ID NO 1-SEQ ID NO 3所示的核苷酸序列。
3.根据权利要求2所述的重组腺相关病毒载体，其特征在于，所述RB1基因的核苷酸序列包含如SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列。
4.根据权利要求1所述的重组腺相关病毒载体，其特征在于，所述AAV2的Cap基因的核苷酸序列包含如SEQ ID NO 4-SEQ ID NO 6所示的核苷酸序列。
5.根据权利要求4所述的重组腺相关病毒载体，其特征在于，所述AAV2的Cap基因的核苷酸序列包含如SEQ ID NO 4所示的核苷酸序列。
6.根据权利要求1所述的重组腺相关病毒载体，其特征在于，所述AAV2的Rep基因的核苷酸序列包含如SEQ ID NO 7-SEQ ID NO 9所示的核苷酸序列。
7.根据权利要求6所述的重组腺相关病
8.一种权利要求1-7中任一项所述的靶向RB1的重组腺相关病毒载体的构建方法，其特征在于，所述构建方法具体包括以下步骤：
9.一种权利要求1-7中任一项所述的靶向RB1的重组腺相关病毒载体在制备用于基因治疗视网膜母细胞瘤的组合物中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种靶向rb1的重组腺相关病毒载体，其特征在于，所述载体的表达框架包括：aav2的cap基因、aav2的rep基因、rb1基因。
2.根据权利要求1所述的重组腺相关病毒载体，其特征在于，所述rb1基因的核苷酸序列包含如seq id no 1-seq id no 3所示的核苷酸序列。
3.根据权利要求2所述的重组腺相关病毒载体，其特征在于，所述rb1基因的核苷酸序列包含如seq id no 1所示的核苷酸序列。
4.根据权利要求1所述的重组腺相关病毒载体，其特征在于，所述aav2的cap基因的核苷酸序列包含如seq id no 4-seq id no 6所示的核苷酸序列。
5.根据权利要求4所述的重组腺相关病毒载体，其特征...
【专利技术属性】
技术研发人员：文旭洋，石寒菡，范佳燕，何晓雨，贾仁兵，范先群，
申请(专利权)人：上海交通大学医学院附属第九人民医院，
类型：发明
国别省市：
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