【技术实现步骤摘要】
本申请涉及基因测序领域，具体涉及一种基因文库的构建方法及在检测病原微生物中的应用。
技术介绍
1、在临床医学领域，感染性疾病一直是急危重症患者生命威胁的主要因素之一。感染病原体主要包括细菌、病毒、真菌和寄生虫等四大类。针对细菌感染，传统的诊断方法主要依赖于培养法，而对于病毒感染，则采用核酸扩增法或特异性抗原抗体检测法。然而，现有的诊断方法在敏感性、特异性、时效性以及提供信息量等方面存在一定的局限性。尤其在面对未知或罕见的病原微生物时，传统方法无法快速准确地识别，这给及时干预和治疗带来了挑战。
技术实现思路
1、本申请旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本申请的一个目的在于提出一种基因文库的构建方法及应用。
2、具体而言，本申请提供了如下技术方案：
3、在本申请的一方面，本申请提出了一种反应液。根据本申请的实施例，该所述反应液包括：40％～60％体积分数的片段化酶反应液、1-10mm datp、0.1-5mm dntp、1000-5000u/ml t4 dna聚合酶、1000-5000u/ml rtaq酶和1000-5000u/ml t4多聚核苷酸激酶。专利技术人通过大量实验验证发现，该反应液应用于测序文库构建过程中，实现了片段化步骤、dna末端修复和加a步骤同步进行，核酸样品的片段化以及末端修复和加a均可在该反应液中进行，极大缩减了建库时间。
4、在本申请的一些示例中，所称片段化酶反应液购自enzymatics，货号：b033
5、根据本申请的实施例，上述反应液还可以包括下列技术特征的至少之一：
6、根据本申请的实施例，所述datp与所述dntp的摩尔比为4:1～6:1。在本申请的一些优选示例中，datp与dntp的摩尔比为5:1。在测序文库构建应用场景中，专利技术人发现datp浓度过高，可能会导致a尾添加得过多，增加了文库构建后的假阳性率(特别是在pcr扩增等步骤中)。相反，如果datp浓度太低，可能无法充分完成a尾修复，导致后续连接或扩增步骤的失败。经过大量优化实验发现，datp与dntp的摩尔比为5:1时，文库构建的效果和质量更好。
7、根据本申请的实施例，该反应液包括包括50％体积分数的片段化酶反应液、2mmdatp、0.4mm dntp、1000u/ml t4 dna聚合酶、1000u/ml taq酶和1000u/ml t4多聚核苷酸激酶。经过专利技术人的大量实验验证，最终发现采用该配比的反应液，反应体系更加稳定，文库构建质量更好。
8、在本申请的第二方面，本申请提出了一种测序文库的构建方法。根据本申请的实施例，所述方法包括：将待测核酸样本在本申请第一方面所述的反应液中进行片段化和末端修复处理；将所述经片段化和末端修复处理的核酸样本进行接头连接处理；对接头连接处理产物进行扩增处理，以便获得所述测序文库。相比于常规构建测序文库的方法，利用本方法构建测序文库，明显缩短实验周期(建库时间缩短1小时左右)，可以大幅节省实验室人工和设备成本。
9、根据本申请的实施例，上述测序文库的构建方法还可以包括下列技术特征的至少之一：
10、根据本申请的实施例，所述片段化和末端修复处理是在如下条件下进行的：30～40℃，15～30min；60～75℃，5～20min。在本申请的一些示例中，随着反应体系的改变，专利技术人对相应的反应程序进行优化，最终发现在前述条件下可同步完成片段化和末端修复步骤。
11、根据本申请的实施例，所述片段化和末端修复处理是在如下条件下进行的30℃，15～30min；72℃，5～20min。专利技术人对片段化和末端修复的最适温度做了筛选，发现在上述温度下，酶活性更好，非特异性剪切或修复更少。
12、根据本申请的实施例，所述片段化和末端修复处理是在如下条件下进行的30℃，20min；72℃，10min。在经过大量实验筛选后，专利技术人确定的最优片段化和末端修复处理反应程序为30℃，20min；72℃，10min。
13、根据本申请的实施例，待测核酸样本来自实体组织样本或体液样本。
14、根据本申请的实施例，体液包括选自血液、脑脊液、痰液和肺泡灌洗液的至少之一。
15、在本申请的第三方面，本申请提出了一种测序文库。根据本申请的实施例，所述测序文库通过本申请第二方面所述的方法制备获得。通过本申请第二方面所述方法制备测序文库，可大幅缩短建库周期，且获得的测序文库质量不低于现有建库方法获得的测序文库。
16、在本申请的第四方面，本申请提出了一种测序方法。根据本申请的实施例，所述方法包括：对本申请第三方面所述的测序文库进行测序。相比以往测序过程，通过对第三方面所述的测序文库进行测序，可快速获得测序数据。
17、根据本申请的实施例，上述测序方法还可以包括下列技术特征的至少之一：
18、根据本申请的实施例，所述测序是在mgiseq-2000或bgiseq-50测序平台上进行的。在本申请的一些示例中，测序平台也可选自illumina公司的hiseq、miseq、nextseq和novaseq测序平台、thermo fisher/life technologies公司的ion torrent平台；测序方式可以选择单端测序、双末端测序或者选择所选用的自动化测序平台可支持的测序方式等。
19、在本申请的第五方面，本申请提出了一种非诊断治疗目的的微生物检测方法。根据本申请的实施例，所述方法包括：利用本申请第二方面所述的方法构建待测核酸样本的测序文库；将所述测序文库进行测序处理，以便获得测序结果；以及将所述测序结果与预定微生物参照基因序列进行比对处理，以获得所述待测核酸样本中的微生物核酸信息。
20、在本申请的一些示例中，利用高通量测序检测病原微生物能够直接对各类样本(如血液、脑脊液、痰液和肺泡灌洗液)中的微生物进行全面、无偏向性的检测，包括细菌、病毒、真菌和寄生虫等。与传统培养相比，无需分离、培养、富集纯化等传统步骤，极大地缩短了检测周期，迅速地获取病原微生物信息。
21、所称的参照基因序列(reference，ref)为已确定的序列，可以是自己预先测定组装的dna和/或rna序列，也可以是他人测定公开的dna和/或rna序列，可以是预先获得的样本来源个体/目标个体所属生物类别中的任意的参考模板，例如，同一生物类别的已公开的基因组组装序列的全部或者至少一部分。
22、在本申请的一些示例中，上述微生物检测方法可用于流行病学研究中，了解不同病原体的传播途径和变异情况，为疾病的防控和预防提供了关键性支持。
23、根据本申请的实施例，上述非诊断治疗目的的微生物检测方法还可以包括下列技术特征的至少之一：
24、根据本申请的实施例，所述待测核酸样本选自实体组织样本或体液样本。
25、根据本申请的实施例，所述体液包括选自血液、脑脊液、痰液和肺泡灌洗液的至本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种反应液，其特征在于，包括：
2.根据权利要求1所述的反应液，其特征在于，所述dATP与所述dNTP的摩尔比为4:1～6:1；优选5:1。
3.根据权利要求1或2所述的反应液，其特征在于，包括50％体积分数的片段化酶反应液、2mM dATP、0.4mM dNTP、1000U/mL T4 DNA聚合酶、1000U/mL Taq酶和1000U/mL T4多聚核苷酸激酶。
4.一种测序文库的构建方法，其特征在于，包括：
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述片段化和末端修复处理是在如下条件下进行的：
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述待测核酸样本来自实体组织样本或体液样本；
7.一种测序文库，其特征在于，所述测序文库通过权利要求4～6任一项所述的方法制备获得。
8.一种测序方法，其特征在于，包括：对权利要求7所述的测序文库进行测序；
9.一种非诊断治疗目的的微生物检测方法，其特征在于，包括：
10.一种试剂盒，其特征在于，包括：权利要求1～3任一项所述的
...【技术特征摘要】
1.一种反应液，其特征在于，包括：
2.根据权利要求1所述的反应液，其特征在于，所述datp与所述dntp的摩尔比为4:1～6:1；优选5:1。
3.根据权利要求1或2所述的反应液，其特征在于，包括50％体积分数的片段化酶反应液、2mm datp、0.4mm dntp、1000u/ml t4 dna聚合酶、1000u/ml taq酶和1000u/ml t4多聚核苷酸激酶。
4.一种测序文库的构建方法，其特征在于，包括：
5.根据权利要求4所述的方法，...
【专利技术属性】
技术研发人员：马珍子，庄元元，林永权，姜丹，栗东芳，彭智宇，张远，熊延狮，赵倩，靳大卫，
申请(专利权)人：深圳华大基因股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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