【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物，具体涉及一种脂肪多能间质干细胞在制备治疗皮肤纤维化药物中的应用。
技术介绍
1、现有技术中，硬皮病是一组以皮肤局部或弥漫性纤维化为特征的结缔组织疾病，也是一种自身免疫疾病，部分类型可合并多脏器纤维化，导致患者死亡，其发病起因尚不明确。其中局灶型通常称为硬斑病，系统型一般指系统性硬化症。目前没有有效的方法治愈硬皮病。有人提出一种新颖的疗法是自体干细胞移植(martini等人，1999)。但是并不清楚具体是哪些细胞因子所起的标志性作用。
2、单细胞转录测序的出现突破了现有技术的瓶颈，通过对组织内每一个细胞进行测序获得其独特的转录组特点，进而根据转录组对每一个细胞进行精确分群。在单细胞测序技术的支持下，绘制组织细胞图谱以及发现组织特异性细胞类型成为可能。
3、目前已有文章报道治疗局限性硬皮病引起的面部凹陷畸形最常用的手术方法采用自体脂肪组织缺损填充，尤其是轻中度的局限性硬皮病患者尤其适用。但是有些治疗效果并不好，具体哪类脂肪干细胞亚群能特异、明显地改善皮肤纤维化并不清楚。
技术实现思路
1、为了解决上述技术问题，本专利技术提供一种基于流式细胞分选治疗皮肤纤维化特异性细胞亚群的方法及应用。本专利技术的目的在于提供一种有效治疗皮肤纤维化的多能间质干细胞。
2、为实现上述目的，本专利技术采用以下的技术方案为：
3、表达cd140a和cd55双阳性的脂肪多能间质干细胞在制备治疗皮肤纤维化药物中的应用。
4、进一步地，
5、一种制备如上所述表达cd140a和cd55双阳性的脂肪多能间质干细胞的方法，其包括如下步骤：
6、1)获取人的脂肪组织，进行svf分离，制备并获得单细胞悬液；
7、2)将步骤1)所得单细胞悬液去除死细胞后进行洗涤；
8、3)洗涤后进行细胞标记，标记采用细胞表面抗体为pe抗人cd140a抗体和apc抗人cd55抗体；
9、4)流式细胞仪检测，先筛选pe抗人cd140a抗体阳性群，阴性群与阳性群分界线在10^2～10^3之间；随后在pe抗人cd140a抗体阳性群中筛选apc抗人cd55抗体阳性群；
10、5)获得表达cd140a阳性且cd55阳性的脂肪多能间质干细胞。
11、进一步地，优选地，步骤1)之前还包括利用单细胞测序技术筛选表达cd55阳性的脂肪多能间质干细胞的步骤，具体包括：
12、(1)取皮肤纤维化疾病组和健康组svf，构建cdna文库，文库测序使用novaseq6000框架；
13、(2)数据降噪和处理，排除在少于3个细胞中表达的基因以减少噪音，根据表达的基因数、umi计数总和和线粒体基因的比例排除细胞异常值，排除小于第一个四分位数-1.5×四分位数范围，排除大于第三个四分位数+1.5×四分位数范围，同时排除双细胞和红细胞；
14、(3)降维和聚类，主成分分析用于线性降维，前30个主成分用于构建细胞的邻域图，umap用于将邻域图嵌入二维空间，seurat中的louvain聚类算法用于细胞聚类，聚类结果脂肪干细胞可分为以下四个亚群：
15、c3-asc多能间质干细胞，该群得到标记物为cd55 high；c0-asc脂肪前体细胞；c1-asc中间态细胞；c5-asc压力反应细胞；
16、(4)分析细胞分化过程中能体现细胞表达水平伪时间图，得到cd55作为c3-asc脂肪干细胞的特异性强的marker。
17、如上所述的方法，优选地，在步骤1)中，先将脂肪组织用hank平衡盐溶液洗涤，并用胶原酶i消化后离心，将底部的细胞沉淀重悬于含有胎牛血清的高糖dulbecco改良培养基中，通过100μm过滤器过滤，并以1500rpm离心5分钟；将获得的细胞悬液重悬于hank平衡盐溶液中，并在室温下加入红细胞裂解缓冲液以消除红细胞；再次离心，将细胞沉淀重悬于含牛血清白蛋白的hank平衡盐溶液中，并通过40μm过滤器过滤；最后，将细胞离心并重悬于不含ca2+和mg2+的dulbecco磷酸盐缓冲盐水中，获得单细胞悬液。
18、如上所述的方法，优选地，在步骤2)中，去除死细胞采用zombie nir染料，之后避光孵育，其zombie nir染料的含量为0.1％的pbs溶液中，避光孵育的时间为10～30min。
19、如上所述的方法，优选地，在步骤2)中，所述洗涤用细胞染色缓冲液以350×g离心5分钟洗涤。
20、如上所述的方法，优选地，在步骤3)中，标记的条件在室温下与细胞表面抗体避光孵育30分钟。
21、如上所述的方法，优选地，在步骤4)中，pe抗人cd140a抗体阳性群阳性率大于66％，apc抗人cd55抗体阳性群中阳性率大于38％。
22、进一步的，采用本专利技术所述的方法获得的cd140a+cd55+的asc具有治疗皮肤纤维化的作用。
23、本专利技术的有益效果在于：
24、本专利技术通过单细胞测序技术发现表达cd55high的asc亚群在疾病组中是降低的，而cd55low的asc在疾病组种没有降低，说明疾病组中表达cd55highasc受到了疾病的影响。
25、本专利技术提供的基于流式细胞分选特异性细胞亚群的方法，能够准确筛选出表达cd140a和cd55双阳的asc亚群，并且该亚群具体有显著治疗皮肤纤维化作用效果。
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1.表达CD140a和CD55双阳性的脂肪多能间质干细胞在制备治疗皮肤纤维化药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述皮肤纤维化的疾病包括硬皮病、硬斑病、嗜酸性筋膜炎、硬肿症、硬化性黏液水肿、皮肌炎、硬化性苔藓、创伤性瘢痕或瘢痕疙瘩造成的皮肤纤维化。
3.一种制备权利要求1所述的表达CD140a和CD55双阳性的脂肪多能间质干细胞的方法，其特征在于，其包括如下步骤：
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤1)之前还包括利用单细胞测序技术筛选CD55阳性的脂肪多能间质干细胞的步骤，具体包括：
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，在步骤1)中，先将脂肪组织用Hank平衡盐溶液洗涤，并用胶原酶I消化后离心，将底部的细胞沉淀重悬于含有胎牛血清的高糖Dulbecco改良培养基中，通过100μm过滤器过滤，并以1500rpm离心5分钟；将获得的细胞悬液重悬于Hank平衡盐溶液中，并在室温下加入红细胞裂解缓冲液以消除红细胞；再次离心，将细胞沉淀重悬于含牛血清白蛋白的Hank平衡盐溶液中，并通过40μm过滤器过滤；
6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，在步骤2)中，去除死细胞采用Zombie NIR染料，之后避光孵育，其Zombie NIR染料的含量为0.1％的PBS溶液中，避光孵育的时间为10～30min。
7.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，在步骤2)中，所述洗涤用细胞染色缓冲液以350×g离心5分钟洗涤。
8.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，在步骤3)中，标记的条件在室温下与细胞表面抗体避光孵育30分钟。
9.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，在步骤4)中，PE抗人CD140a抗体阳性群阳性率大于66％，APC抗人CD55抗体阳性群中阳性率大于38％。
...【技术特征摘要】
1.表达cd140a和cd55双阳性的脂肪多能间质干细胞在制备治疗皮肤纤维化药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述皮肤纤维化的疾病包括硬皮病、硬斑病、嗜酸性筋膜炎、硬肿症、硬化性黏液水肿、皮肌炎、硬化性苔藓、创伤性瘢痕或瘢痕疙瘩造成的皮肤纤维化。
3.一种制备权利要求1所述的表达cd140a和cd55双阳性的脂肪多能间质干细胞的方法，其特征在于，其包括如下步骤：
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤1)之前还包括利用单细胞测序技术筛选cd55阳性的脂肪多能间质干细胞的步骤，具体包括：
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，在步骤1)中，先将脂肪组织用hank平衡盐溶液洗涤，并用胶原酶i消化后离心，将底部的细胞沉淀重悬于含有胎牛血清的高糖dulbecco改良培养基中，通过100μm过滤器过滤，并以1500rpm离心5分钟；将获得的细胞悬液重悬于hank平衡盐溶液中...
【专利技术属性】
技术研发人员：龙笑，李竹君，刘宣雨，杨跃梅，安文强，刘俊江，
申请(专利权)人：中国医学科学院北京协和医院，
类型：发明
国别省市：
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