一种猪精液冷冻保存方法技术

本发明专利技术公开了一种猪精液冷冻保存方法。该方法要求精液样品新鲜精液活力≥０．７，冷冻方法按以下操作步骤进行：１）猪精液冷冻稀释液配方与稀释液的配制；２）精液稀释；３）精液预冷平衡；４）精液的滴冻；５）精液解冻和冻后活力检查。本发明专利技术的益效是：本发明专利技术进一步丰富了猪精液冷冻保存的方法。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属生物
，具体是一种猪精液冷冻方法。
技术介绍
国内也有一些单位研究和优化猪精液冷冻保存方法，例如西北农林科技大学、浙江大学等，我们研制的方法与他们不同，本专利技术进一步丰富了猪精液冷冻保存的方法。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供。本专利技术解决上述技术问题的技术方案如下，精液样品要求新鲜精液活力> 0. 7，冷冻方法按以下操 作步骤进行1.猪精液冷冻稀释液配方与稀释液的配制1. 1猪精液冷冻稀释液配方稀释液分为常温稀释液和冷冻稀释液1. 1. 1常温稀释液配方常温稀释液由葡萄糖32. 0g/L;TES 12. Og/L ；Tris 2. Og/L ；KCl 0. 8g/ L ；EDTA-Na2 1. 5g/L ；甘氨酸 5. Og/L ；青霉素(Penicillin G) 10000IU/L,硫酸链霉 (Streptomycin sulfate)0. 05g/Lo1.1. 2冷冻稀释液配方在常温稀释液的基础上加卵黄20% (ν/ν)、甘油6% (ν/ν)即为冷冻稀释液。1.2.稀释液的配制1. 2. 1常温稀释液的配制准确称量所需药品至事先经过灭菌过的圆底烧瓶中，并用封口膜封好瓶口，置于 4°C冰箱中待用。1. 2. 2冷冻稀释液的配制新鲜鸡蛋1 2只，先用75%的酒精消毒鸡蛋表面、镊子及手，待酒精干后用消毒 好的镊子轻轻敲开鸡蛋大头(气室)面，去掉蛋清，用IOml —次性注射器去掉针头抽取所 需卵黄量，置于事先消毒好的离心管中，然后放到离心机中离心去除卵黄颗粒。如需配冷冻 稀释液IOml时，取常温稀释液7. 4ml，卵黄上清2ml，甘油0. 6ml混勻即为冷冻稀释液，冷冻 稀释液为现配现用。2.精液稀释2.1常温稀释液的稀释在猪精液一经采出来后，马上用常温稀释液1 1稀释，然后快速将精液运送回实 验室，一般要求尽快把精液送回实验室。2. 2冷冻稀释液的稀释当精液送回实验室后离心去除1/2上清，其沉淀物用II液1 1稀释后，检查活 力，如精液活力> 0. 7即可进行精液预冷平衡。3.精液预冷平衡把稀释好的精液用4 6层纱布包裹后放置4°C冰箱中平衡4h。4.精液的滴冻 把液氮倒到一个泡沫箱中，在液氮上方5cm高处放置一个铝盘，铝盘要预冷 IOmin0把平衡好的精液按0. 25ml/滴滴在铝盘上，盖上泡沫箱盖，IOmin后把颗粒铲进液氮 中。5.精液解冻和冻后活力检查从液氮中抽取1 2颗精液放进离心管或玻璃小瓶中，置于50°C的水中进行解冻， 解冻标准为精液刚好溶解1/2即可，放置37°C恒温箱中5min，然后精子图像计算机辅助分 析仪(CASA)进行活力的检查，重复检查两次结果取平均值。本专利技术的益效是本专利技术进一步丰富了猪精液冷冻保存的方法。具体实施例方式下面结合实施例对本专利技术作进一步描述。实施例一种猪精液冷冻方法，精液样品要求新鲜精液活力> 0. 7，冷冻方法按以下操作步 骤进行1.猪精液冷冻稀释液配方与稀释液的配制1. 1猪精液冷冻稀释液配方稀释液分为常温稀释液和冷冻稀释液1. 1. 1常温稀释液配方常温稀释液由葡萄糖32. Og/L ；TES 12. Og/L ；Tris 2. Og/L ；KCl 0. 8g/ L ；EDTA-Na2 1. 5g/L ；甘氨酸 5. Og/L ；青霉素(Penicillin G) 10000IU/L,硫酸链霉 (Streptomycin sulfate)0. 05g/Lo1. 1. 2冷冻稀释液配方在常温稀释液的基础上加卵黄20% (ν/ν)、甘油6% (ν/ν)即为冷冻稀释液。1. 2.稀释液的配制1. 2. 1常温稀释液的配制准确称量所需药品至事先经过灭菌过的圆底烧瓶中，并用封口膜封好瓶口，置于 4°C冰箱中待用。1. 2. 2冷冻稀释液的配制新鲜鸡蛋1 2只，先用75%的酒精消毒鸡蛋表面、镊子及手，待酒精干后用消毒 好的镊子轻轻敲开鸡蛋大头(气室)面，去掉蛋清，用IOml —次性注射器去掉针头抽取所 需卵黄量，置于事先消毒好的离心管中，然后放到离心机中离心去除卵黄颗粒。如需配冷冻 稀释液IOml时，取常温稀释液7. 4ml，卵黄上清2ml，甘油0. 6ml混勻即为冷冻稀释液，冷冻 稀释液为现配现用。2.精液稀释2. 1常温稀释液的稀释在猪精液一经采出来后，马上用常温稀释液1 1稀释，然后快速将精液运送回实验室，一般要求尽快把精液送回实验室。2. 2冷冻稀释液的稀释当精液送回实验室后离心去除1/2上清，其沉淀物用II液1 1稀释后，检查活 力，如精液活力> 0. 7即可进行精液预冷平衡。3.精液预冷平衡把稀释好的精液用4 6层纱布包裹后放置4°C冰箱中平衡4h。4.精液的滴冻把液氮倒到一个泡沫箱中，在液氮上方5cm高处放置一个铝盘，铝盘要预冷 IOmin0把平衡好的精液按0. 25ml/滴滴在铝盘上，盖上泡沫箱盖，IOmin后把颗粒铲进液氮 中。5.精液解冻和冻后活力检查从液氮中抽取1 2颗精液放进离心管或玻璃小瓶中，置于50°C的水中进行解冻， 解冻标准为精液刚好溶解1/2即可，放置37°C恒温箱中5min，然后精子图像计算机辅助分 析仪(CASA)进行活力的检查，重复检查两次结果取平均值。6.精子的质膜完整性采用低渗肿胀实验(HOST)进行检测。取5yL解冻精液放入ImL低渗液中 (1.3512g果糖和0. 7352g 二水柠檬酸钠溶于IOOmL去离子水)混勻。孵育30min后，取 20 μ L精液滴在血细胞计数板上，在400 X相差显微镜下观察精子尾部情况，分析精子质膜 情况。7.精子的顶体完整性顶体完整率检查参照江一平等_报道的方法，用考马斯亮蓝R250染色液对解冻 精子进行染色，然后在1000Χ显微镜下检查精子畸形率和顶体完整率。每个处理制片2张， 每片记数200个以上的精子。8.精子的线粒体活性按JC-I试剂盒说明书操作。JC-I染液的配制(2. 5 μ 1 JC-I染料+100 μ L JC缓 冲液+400 μ L超纯水)/样本，避光放置。洗涤液的配制(400 μ L JC缓冲液+1600 μ L超纯 水)/样本。取8mL解冻精液加ImL PBS轻轻打勻，2000r/min离心6min，总共洗两次。然 后，加JC-I染液和PBS各0. 5mL，混勻后在37°C水浴锅中蔽光孵育30min。孵育后，再用配 制好的洗涤液洗两次(2000r/min离心6min)。400X荧光显微镜下观察。9.试验设计在冷冻稀释液基础上添加不同浓度(0，0.5g/L，lg/L，1.5g/L)的牛血清白蛋白 (BSA)作为试验组。然后根据解冻后，精子的活率、活力、质膜完整率、顶体完整率和线粒体 活性等指标来评定冻后精子的质量。10.统计分析对试验数据用SAS统计软件进行分析。把活率、活力、质膜完整率、顶体完整率和 线粒体活性的数据进行反正弦转换，再用一般线性模型下的Duncan’ s多重比较检验各组 之间差异的显著性。结果与分析 试验重复6次。从表1的试验分析结果可知，添加不同浓度(0. 5g/L，lg/L，1. 5g/ L)的BSA与对照组相比，冻后精子的活率、活力、质膜完整率、顶体完整率和线粒体活性均 无显著差异(P本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种猪精液冷冻保存方法，其特征在于，精液样品要求新鲜精液活力≥０．７，冷冻方法按以下操作步骤进行：１）猪精液冷冻稀释液配方与稀释液的配制１．１）猪精液冷冻稀释液配方稀释液分为常温稀释液和冷冻稀释液１．１．１）常温稀释液配方常温稀释液由葡萄糖３２．０ｇ／Ｌ；ＴＥＳ１２．０ｇ／Ｌ；Ｔｒｉｓ２．０ｇ／Ｌ；ＫＣｌ０．８ｇ／Ｌ；ＥＤＴＡ－Ｎａ２１．５ｇ／Ｌ；甘氨酸５．０ｇ／Ｌ；青霉素（ＰｅｎｉｃｉｌｌｉｎＧ）１００００ＩＵ／Ｌ，硫酸链霉（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎｓｕｌｆａｔｅ）０．０５ｇ／Ｌ；１．１．２）冷冻稀释液配方在常温稀释液的基础上加卵黄２０％（ｖ／ｖ）、甘油６％（ｖ／ｖ）即为冷冻稀释液；１．２．）稀释液的配制１．２．１）常温稀释液的配制准确称量所需药品至事先经过灭菌过的圆底烧瓶中，并用封口膜封好瓶口，置于４℃冰箱中待用；１．２．２）冷冻稀释液的配制新鲜鸡蛋１～２只，先用７５％的酒精消毒鸡蛋表面、镊子及手，待酒精干后用消毒好的镊子轻轻敲开鸡蛋大头（气室）面，去掉蛋清，用１０ｍｌ一次性注射器去掉针头抽取所需卵黄量，置于事先消毒好的离心管中，然后放到离心机中离心去除卵黄颗粒。如需配冷冻稀释液１０ｍｌ时，取常温稀释液７．４ｍｌ，卵黄上清２ｍｌ，甘油０．６ｍｌ混匀即为冷冻稀释液，冷冻稀释液为现配现用；２）精液稀释２．１）常温稀释液的稀释在猪精液一经采出来后，马上用常温稀释液１∶１稀释，然后快速将精液运送回实验室，一般要求尽快把精液送回实验室；２．２）冷冻稀释液的稀释当精液送回实验室后离心去除１／２上清，其沉淀物用ＩＩ液１∶１稀释后，检查活力，如精液活力≥０．７即可进行精液预冷平衡；３）精液预冷平衡把稀释好的精液用４～６层纱布包裹后放置４℃冰箱中平衡４ｈ；４）精液的滴冻把液氮倒到一个泡沫箱中，在液氮上方５ｃｍ高处放置一个铝盘，铝盘要预冷１０ｍｉｎ。把平衡好的精液按０．２５ｍｌ／滴滴在铝盘上，盖上泡沫箱盖，１０ｍｉｎ后把颗粒铲进液氮中；５）精液解冻和冻后活力检查从液氮中抽取１～２颗精液放进离心管或玻璃小瓶中，置于５０℃的水中进行解冻，解冻标准为精液刚好溶解１／２即可，放置３７℃恒温箱中５ｍｉｎ，然后精子图像计算机辅助分析仪（ＣＡＳＡ）进行活力的检查，重复检查两次结果取平均值。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：卢晟盛，卢克焕，李林，
申请(专利权)人：广西大学，
类型：发明
国别省市：45[中国|广西]