【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物医药，更具体地涉及一种门冬胰岛素衍生物的制备方法。
技术介绍
1、糖尿病已经成为威胁人类健康的最主要的慢性病之一，胰岛素作为治疗糖尿病的最常用药物其研究一直是生物医药领域的热点。门冬胰岛素作为一种速效胰岛素，与传统的人胰岛素相比，门冬胰岛素控制血糖的效果显著，起效快，副作用少。而临床实践证明，门冬胰岛素制剂的免疫原性与其纯度明显相关，制剂中的大分子杂质以及脱酰胺衍生物的存在是造成临床应用中各种免疫副作用的重要原因。随着《中华人民共和国药典》2020年版的颁布实施，关于生物制品胰岛素的质量控制提出了进一步的要求，明确规定了胰岛素的纯度及相关杂质(如脱酰胺产物等)的范围。
2、制备门冬胰岛素衍生物，并经过进一步的纯化得到衍生物标准品，将其作为检测门冬胰岛素功能活性的重要指标，在门冬胰岛素质量控制、制剂配方优化、储存条件筛选等方面发挥重要作用。然而，目前本领域关于门冬胰岛素衍生物对照品或标准品的制备方法还鲜有报道。
3、因此，本领域急需提供一种新的门冬胰岛素衍生物对照品或标准品的制备方法。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供一种门冬胰岛素衍生物的制备方法。
2、在本专利技术的第一方面，提供了一种门冬胰岛素衍生物的制备方法，所述的方法包括：
3、(s1)提供一门冬胰岛素溶液；
4、(s2)向含有所述门冬胰岛素溶液的反应体系中加入c％(v/v)的三氟乙酸，在温度t下进行脱酰胺反应，反应a时间，从而获得含有门
5、(s3)对所述反应液进行分离纯化，从而获得门冬胰岛素衍生物，所述的门冬胰岛素衍生物选自下组：b28 iso asp、b3 asp、a21 asp、或其组合。
6、在另一优选例中，在步骤(s2)中，进行脱酰胺反应后的所述的反应液中，asp、b28iso asp、b3 asp和a21 asp的纯度分别为z0、z1、z2、z3，其中，
7、(z1+z2+z3)/(z0+z1+z2+z3)≥10％，≥20％，≥30％；较佳地为20-80％；更佳地30-70％。
8、在另一优选例中，在步骤(s2)中，进行脱酰胺反应后的所述的反应液中，
9、z1/(z1+z2+z3)≥10％，≥15％，≥20％；较佳地为10-30％。
10、在另一优选例中，在步骤(s2)中，进行脱酰胺反应后的所述的反应液中，
11、z2/(z1+z2+z3)≥20％，≥35％，≥40％；较佳地为50-70％。
12、在另一优选例中，在步骤(s2)中，进行脱酰胺反应后的所述的反应液中，
13、z3/(z1+z2+z3)≥10％，≥20％，≥30％；较佳地为10-40％。
14、在另一优选例中，在步骤(s2)中，进行脱酰胺反应后的所述的反应液中，门冬胰岛素的消耗百分比≥20％，≥40％，≥60％；较佳地为20-90％，40-85％，更佳地50-80％。
15、在另一优选例中，所述“门冬胰岛素的消耗百分比”为进行脱酰胺反应后的所述的反应液中的门冬胰岛素(残余的门冬胰岛素)与反应前门冬胰岛素的质量比或含量比。
16、在另一优选例中，步骤(s1)中，所述门冬胰岛素溶液的浓度为1.0-5.0mg/ml；较佳地2.0-4.0mg/ml；较佳地3.4-3.6mg/ml；更佳地3.5mg/ml。
17、在另一优选例中，步骤(s2)中，所述c％为2-8％(v/v)；较佳地4-6％(v/v)，更佳地5％(v/v)。
18、在另一优选例中，步骤(s2)中，所述c％为三氟乙酸(tfa)样品体积中的浓度。
19、在另一优选例中，步骤(s2)中，所述温度t为25-40℃；较佳地为30-40℃；最佳地为35±2℃。
20、在另一优选例中，步骤(s2)中，所述反应时间a为15-60h；较佳地为20-48h；更佳地为24±4h；最佳地24±2h。
21、在另一优选例中，步骤(s2)中，还包括：终止脱酰胺反应。
22、在另一优选例中，步骤(s2)中，所述终止脱酰胺反应包括：加入碱性溶液，使反应液的ph调至9.0～10.0。
23、在另一优选例中，步骤(s2)中，所述碱性溶液包括：氢氧化钠溶液或碳酸钠溶液。
24、在另一优选例中，所述碱性溶液为10mol/l氢氧化钠溶液。
25、在另一优选例中，步骤(s2)中，加入5-10mol/l氢氧化钠溶液终止反应，样品ph9.0～10.0。
26、在另一优选例中，步骤(s2)中，纯化所述的门冬胰岛素衍生物，分别获得b28 isoasp、b3 asp和/或a21 asp。
27、在另一优选例中，步骤(s3)中，所述纯化包括：对反应液进行第一次纯化，分别获得门冬胰岛素衍生物的第一纯化产物。
28、在另一优选例中，所述纯化还包括：
29、对第一纯化产物分别进行第二次纯化，获得门冬胰岛素衍生物的第二纯化产物。
30、在另一优选例中，所述门冬胰岛素衍生物包括：b28 iso asp、b3 asp或a21 asp。
31、在另一优选例中，所述门冬胰岛素衍生物的第一纯化产物是通过以下的方法获得的：
32、将门冬胰岛素衍生物的反应液注入高效液相色谱仪，并采用如下高效液相色谱条件进行制备：
33、色谱柱：反相色谱柱；
34、流动相：流动相a和流动相b的混合液；
35、所述的流动相a包括含有无机盐的酸水溶液；
36、所述的流动相b包括：c1-c4醇、c2-c4腈，或c1-c4醇、c2-c4腈与流动相a的混合液、或其组合；
37、流动相洗脱：所述的流动相洗脱为梯度洗脱，分段收集洗脱峰，hplc检测，根据目的蛋白纯度及浓度变化趋势合并样品，得到门冬胰岛素衍生物的第一纯化产物。
38、在另一优选例中，所述纯化使用反相层析柱(kromasil c8 10-100)进行。
39、在另一优选例中，所述的流动相a中，所述的酸水溶液中酸选自下组：柠檬酸、甲酸、乙酸、三氟乙酸、磷酸，或其组合。
40、在另一优选例中，所述的流动相a中，所述的酸水溶液中酸的含量为0.05-8％(v/v)，较佳地0.08-6％(v/v)，更佳地0.1-5％(v/v)，以流动相a的体积计算。
41、在另一优选例中，所述的流动相a中，所述的无机盐的浓度为5-500mmol/l，较佳地10-200mmol/l，更佳地20-150mmol/l，更佳地30-100mmol/l，以流动相a的总体积计算。
42、在另一优选例中，所述的c1-c4醇选自下组：甲醇、乙醇、异丙醇，或其组合；和/或所述本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种门冬胰岛素衍生物的制备方法，其特征在于，所述的方法包括：
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(S2)中，进行脱酰胺反应后的所述的反应液中，Asp、B28 iso Asp、B3 Asp和A21 Asp的纯度分别为Z0、Z1、Z2、Z3，其中，
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(S1)中，所述门冬胰岛素溶液的浓度为1.0-5.0mg/ml；较佳地2.0-4.0mg/ml；较佳地3.4-3.6mg/ml；更佳地3.5mg/ml。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(S2)中，所述c％为2-8％(v/v)；较佳地4-6％(v/v)，更佳地5％(v/v)，所述c％为三氟乙酸(TFA)样品体积中的浓度。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(S2)中，所述温度T为25-40℃；较佳地为30-40℃；最佳地为35±2℃。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(S2)中，所述反应时间A为6-72h，较佳地为15-60h；较佳地为20-48h；更佳地为24±4h，最佳地24±2h。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(S3)中，所述纯化包括：对反应液进行第一次纯化，分别获得门冬胰岛素衍生物的第一纯化产物。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述纯化还包括：
9.一种门冬胰岛素衍生物对照品或标准品，其特征在于，包括权利要求1-8任一项所述方法制备得到的门冬胰岛素衍生物。
10.一种检测门冬胰岛素中衍生物的种类或含量的方法，其特征在于，包括步骤：
...【技术特征摘要】
1.一种门冬胰岛素衍生物的制备方法，其特征在于，所述的方法包括：
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(s2)中，进行脱酰胺反应后的所述的反应液中，asp、b28 iso asp、b3 asp和a21 asp的纯度分别为z0、z1、z2、z3，其中，
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(s1)中，所述门冬胰岛素溶液的浓度为1.0-5.0mg/ml；较佳地2.0-4.0mg/ml；较佳地3.4-3.6mg/ml；更佳地3.5mg/ml。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(s2)中，所述c％为2-8％(v/v)；较佳地4-6％(v/v)，更佳地5％(v/v)，所述c％为三氟乙酸(tfa)样品体积中的浓度。
5.如权利要求1所述的方...
【专利技术属性】
技术研发人员：唐亚连，牟瑶瑶，唐杰，
申请(专利权)人：宁波鲲鹏生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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