【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物，具体涉及一种冷冻休克处理的装载减毒沙门氏菌的单核细胞或巨噬细胞的制备方法及其应用。
技术介绍
1、细菌疗法正在改变肿瘤治疗的治疗模式，这些治疗细菌在给药后因其自身的兼性厌氧特性以及实体肿瘤微环境特有特征，包括实体肿瘤内部乏氧环境，免疫抑制环境和大量坏死细胞释放出的养料，而能够在注射给药后实现于实体肿瘤部位的优先定殖(gurbatri cr et al.,2020,sci transl med,12(530)；zhou s et al.,2018,nat revcancer,18(12):727-43；suh s et al.,2019,adv sci,6(3):1801309)，随后是显著的肿瘤内免疫激活(wu l et al.,adv drug deliv rev2022,187:114363)。然而，直接注射异源微生物通常都会在体内引发快速的免疫反应，导致机体产生不适和潜在的不良反应。现已有研究证明，活菌直接给药会对宿主产生毒性，从而限制了患者对细菌耐受的剂量和效果(wul et al.,adv drug deliv rev 2022,187:114363；gurbatri cr et al.,science,2022,378(6622):858-864)。vnp20009是一种鼠伤寒沙门氏菌的减毒株(以下简述为vnp)，因其更低的生物毒性与临床前良好的抑瘤效果而受到广泛的关注(clairmont c et al.,2000,jinfect dis,181:1996-2002)。尽管通过两种基因(puri
2、近些年来，多种类型的白细胞，包括巨噬细胞、中性粒细胞，t细胞等，因其对肿瘤区域独特的趋化效应而被用作有效的肿瘤药物递送载体(xie z et al.,2017,small,13(10)；xue j etal.,2017,nat nanotechnol,12(7):692-700；huang b et al.,2015,scitransl med,7(291):291ra94)。一种理想的细胞药物载体应易于制备、且可快速获取，这对于以干细胞或原代细胞为主要来源的免疫细胞载体来说很难实现。因为这类细胞通常体外培养条件复杂且增殖效率低下。一些永生化的免疫细胞系，如巨噬细胞(macs)系raw264.7，j774.1，ana-1，ibmdm，u937，单核细胞(mc)系thp1，ibmmc，j-111，mono-mac-1，josk-m等，具有持续增殖和易于培养的特点，理论上可解决常规细胞治疗中细胞获取困难的痛点。然而，这些细胞系因其持续增殖的能力而伴随着潜在的致病性。通常，活细胞的结构会在死亡时解体，导致蛋白质和细胞因子的损失(green dr et al.,cold spring harb perspectbiol.,2015；7(12):a006080)。此外，可能诱导细胞死亡的外部刺激，例如热或辐射，也会使蛋白质失活(sanchez y et al.,science,1990；248(4959):1112-1115；prise km et al.,lancet oncol.,2005；6(7):520-528)。已有研究表明，将活肿瘤细胞经液氮速冻冷处理可在使其失去生长能力的同时，可保持其细胞结构的完整性以及膜上蛋白的生物活性(ci tet al.,sci adv.,2020；6(50):eabc3013；meng j et al.,nat commun.,2023；14(1):4505)。
3、因此，能否通过液氮冷处理获得“死的”但“有功能的”永生化免疫细胞系，以消除细胞系致病性的同时，兼顾易获取性；进一步地，借助免疫细胞系装载细菌后再液氮冷处理，基于细胞的伪装保护及依赖细胞的肿瘤靶向递送，可避免细菌的脱靶及异源物质的直接大量暴露而引发的毒副反应；而菌株在免疫细胞内的刺激作用进一步促进了胞内抗肿瘤炎症因子与粘附因子的产生，对应更强的抗癌疗效与瘤内富集效应。
技术实现思路
1、本专利技术的目的是提供一种冷冻休克处理的装载减毒沙门氏菌的单核细胞或巨噬细胞的制备方法及其应用，具体来说，是借助单核细胞/巨噬细胞等免疫细胞体外装载减毒沙门氏菌，随后用液氮快速冷处理获得冷冻休克处理的装载减毒沙门氏菌的单核细胞/巨噬细胞，及其联合应用治疗肿瘤的方案。
2、为解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案如下：第一方面，本申请提供一种冷冻休克处理的装载减毒沙门氏菌的单核细胞或巨噬细胞的制备方法。
3、第二方面，本申请提供一种冷冻休克处理的装载减毒沙门氏菌的单核细胞或巨噬细胞的制备方法制得的冷冻休克处理的装载减毒沙门氏菌的单核细胞或巨噬细胞。
4、第三方面，本申请提供一种冷冻休克处理的装载减毒沙门氏菌的单核细胞或巨噬细胞的制备方法在制备抗肿瘤药物制剂中的应用。
5、本专利技术的一种冷冻休克处理的装载减毒沙门氏菌的单核细胞或巨噬细胞的制备方法，包括如下步骤：所述冷冻休克处理的装载减毒沙门氏菌的单核细胞或巨噬细胞为永生化的单核细胞系或巨噬细胞系与减毒鼠伤寒沙门氏菌以moi值1-100共培养，获得装载减毒沙门氏菌的工程化细胞，再经由液氮进行冷休克处理，制得冷冻休克处理的装载减毒沙门氏菌的单核细胞或巨噬细胞。
6、单核细胞系/巨噬细胞系丧失了原有的潜在致病性，而胞内的减毒沙门氏菌可维持生物活性，在体外再度释放而出后，可在24小时达到生长平台期。相较单一注射冷休克处理的减毒沙门氏菌、以及冷休克处理的巨噬细胞与冷休克处理的减毒沙门氏菌二者的简单混合的方法相比较，借助冷冻休克巨噬细胞对菌体的伪装保护与靶向递送用于肿瘤治疗后，小鼠的肿瘤生长得到更显著抑制，存活时间显著延长。
7、进一步地，(1)将单核细胞系或巨噬细胞系中的任意一种细胞与减毒沙门氏菌共孵育：
8、将生长条件良好的所述单核细胞或巨噬细胞以1-100×105个/孔的比例接种于培养皿中，用不含抗生素的细胞培养液进行培养，从琼脂平板上挑取减毒沙门氏菌单克隆菌株，在lb型液体培养基中过夜活化，将生长到对数相的菌液5000-8000转/分钟、离心5-10min，弃上清将沉淀重悬于无菌生理盐水中，调节od600为0.6-1.2后，将细菌加入装有上述细胞以moi值1-100的培养皿中，共同培养20-150分钟；
9、(2)用hoechst对细胞核进行染色后，在显微镜下观察细胞的形态变化；记录细胞与细菌共培养不同时间点，对应上述一种单核细胞/巨噬细胞的破碎百分率的变化；不同时间后，弃上清液，用无菌pbs洗涤2～3次，本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种冷冻休克处理的装载减毒沙门氏菌的单核细胞或巨噬细胞的制备方法，其特征在于包括如下步骤：所述冷冻休克处理的装载减毒沙门氏菌的单核细胞或巨噬细胞为永生化的单核细胞系或巨噬细胞系与减毒鼠伤寒沙门氏菌以MOI值1-100共培养，获得装载减毒沙门氏菌的工程化细胞，再经由液氮进行冷休克处理，制得冷冻休克处理的装载减毒沙门氏菌的单核细胞或巨噬细胞。
2.根据权利要求1所述的冷冻休克处理的装载减毒沙门氏菌的单核细胞或巨噬细胞的制备方法，其特征在于：(1)将单核细胞系或巨噬细胞系中的任意一种细胞与减毒沙门氏菌共孵育：
3.根据权利要求1或2所述的冷冻休克处理的装载减毒沙门氏菌的单核细胞或巨噬细胞的制备方法，其特征在于：在步骤(1)或步骤(2)中，所述减毒鼠伤寒沙门氏菌为减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009及其基因改造菌株和可实现药物蛋白产生的合成生物学改造工程菌株，所述永生化的单核细胞系/巨噬细胞系包括THP1、iBMMC、J-111、Mono-Mac-1、JOSK-M、RAW264.7、J774.1、Ana-1、iBMD或U937中的任意一种；其中，所述单核细胞包括
4.根据权利要求2所述的冷冻休克处理的装载减毒沙门氏菌的单核细胞或巨噬细胞的制备方法，其特征在于：在步骤(2)中，在综合考虑菌株装载量与细胞完整性后，选择共培养时间60分钟为制备活的CELL/VNP细胞最优时间点，该时间下细胞内活菌的负载高，负载为每100个细胞装载257±27个菌株，且细胞完整性>90％。
5.权利要求1所述的制备方法制得的冷冻休克处理的装载减毒沙门氏菌的单核细胞或巨噬细胞。
6.权利要求1所述的冷冻休克处理的装载减毒沙门氏菌的单核细胞或巨噬细胞的制备方法在制备抗肿瘤药物制剂中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：冷冻休克处理的装载减毒沙门氏菌的单核细胞或巨噬细胞治疗剂量为0.4-40×106细胞，所述单位为细胞/只小鼠，对应实际减毒沙门氏菌菌量为0.1-10×107CFU，所述单位为CFU/只小鼠；冷冻休克处理的装载减毒沙门氏菌的单核细胞/巨噬细胞给药次数为单次给药。
8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述药物制剂包括静脉注射制剂、瘤内注射剂制或腹腔注射剂中的至少一种。
9.权利要求6所述的应用与其他常规抗肿瘤药物或方法的联合应用。
...【技术特征摘要】
1.一种冷冻休克处理的装载减毒沙门氏菌的单核细胞或巨噬细胞的制备方法，其特征在于包括如下步骤：所述冷冻休克处理的装载减毒沙门氏菌的单核细胞或巨噬细胞为永生化的单核细胞系或巨噬细胞系与减毒鼠伤寒沙门氏菌以moi值1-100共培养，获得装载减毒沙门氏菌的工程化细胞，再经由液氮进行冷休克处理，制得冷冻休克处理的装载减毒沙门氏菌的单核细胞或巨噬细胞。
2.根据权利要求1所述的冷冻休克处理的装载减毒沙门氏菌的单核细胞或巨噬细胞的制备方法，其特征在于：(1)将单核细胞系或巨噬细胞系中的任意一种细胞与减毒沙门氏菌共孵育：
3.根据权利要求1或2所述的冷冻休克处理的装载减毒沙门氏菌的单核细胞或巨噬细胞的制备方法，其特征在于：在步骤(1)或步骤(2)中，所述减毒鼠伤寒沙门氏菌为减毒鼠伤寒沙门氏菌vnp20009及其基因改造菌株和可实现药物蛋白产生的合成生物学改造工程菌株，所述永生化的单核细胞系/巨噬细胞系包括thp1、ibmmc、j-111、mono-mac-1、josk-m、raw264.7、j774.1、ana-1、ibmd或u937中的任意一种；其中，所述单核细胞包括单核细胞系thp1、ibmmc、j-111、mono-mac-1或josk-m中的任意一种，所述巨噬细胞包括巨噬细胞系raw264.7、...
【专利技术属性】
技术研发人员：华子春，吴乐阳，杜曾铮，
申请(专利权)人：江苏靶标生物医药研究所有限公司，
类型：发明
国别省市：
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