一种比法卢定的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种多肽固相合成比法卢定（Ｂｉｖａｌｉｒｕｄｉｎ）的制备方法，所述的方法包括步骤：（１）在缩合剂存在下将Ｆｍｏｃ－Ａｓｎ（Ｔｒｔ）－Ｇｌｙ－ＯＨ和如式Ｖ所示的多肽树脂缩合，得到如式ＩＩＩ所示的多肽树脂；（２）将如式ＩＩＩ所示的多肽树脂和去保护剂混合，除去Ｆｍｏｃ保护基；（３）在缩合剂存在下将Ｆｍｏｃ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－ＯＨ和如式ＶＩ所示的多肽树脂缩合，得到如式ＩＶ所示的多肽树脂；（４）通过固相合成的方法将氨基酸自Ｃ端向Ｎ端按照Ｐｒｏ至Ａｒｇ至Ｐｒｏ至Ｄ－Ｐｈｅ的顺序依次同如式ＩＶ所示的多肽树脂上的多肽缩合，形成如式ＩＩ所示的多肽树脂；和（５）在切割剂的存在下使式ＩＩ所示多肽树脂上的多肽和树脂分离，得到如式Ｉ所示的比法卢定；

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及多肽固相合成领域，尤其涉及比法卢定(Bivalirudin)的固相合成方法。
技术介绍
在肽合成的技术方面取得了突破性进展的是R. Bruce Merrifield，他设计了一种 肽的合成途径并定名为固相合成途径。首先将一个氨基被封闭基团保护的氨基酸共价连接 在固相载体上；在去保护剂的作用下，脱掉氨基的保护基，这样第一个氨基酸就接到了固相 载体上了。然后氨基被封闭的第二个氨基酸的羧基通过试剂活化，羧基被DCC活化的第二 个氨基酸再与已接在固相载体的第一个氨基酸的氨基反应形成肽键，这样在固相载体上就 生成了一个带有保护基的二肽。重复上述肽键形成反应，使肽链从C端向N端生长，直至达 到所需要的肽链长度。最后脱去保护基，用HF水解肽链和固相载体之间的酯键，就得到了 合成好的肽。多肽合成是一个重复添加氨基酸的过程，固相合成顺序一般从C端(羧基端) 向N端(氨基端)合成。凝血酶抑制剂被认为是很有前途的抗血栓药通过凝血酶进行的蛋白水解过程 是血液凝结控制的关键所在。抗凝血肽比伐卢定(bivalirudin)，即所谓的“二价水蛭 素(hirulog)”。水蛭素是一种获自吸血水蛭-医用水蛭Hirudo medicinalis的有效治 疗性凝血酶肽抑制剂，其包含20个氨基酸，属于强有力的凝血酶直接抑制剂。比伐卢定 (bivalirudin)是一种近年来应用于临床的直接凝血酶抑制剂，于2000年批准在美国上 市，其有效抗凝成分为水蛭素衍生物片段，通过直接并特异性抑制凝血酶活性而发挥抗凝 作用，作用可逆而短暂。比法卢定可以作为普通肝索和血小板糖蛋白II b/11 a拮抗剂的 替代药物应用于非高危患者的经皮冠脉介入治疗。US20070093423A公开了一种多肽固相合成比法卢定的方法，其采用固液相合成方 法，将 Phe-Pro-Arg(Pbf) -Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn (Trt)-Gly 和 Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu两个片段耦合反应形成比法卢定。该方法的成本较高，产生的杂质多，产品纯度有限。US20090062511A公开了一种固相合成比法卢定的方法，其采用固相合成方法，操 作繁琐，产生的杂质多。因此，本领域迫切需要提供一种多肽固相合成比法卢定的新方法，其成本低 廉、得到的比法卢定纯度高，可以有效去除HPLC主峰前、后的(即 Bivalirudin 少一 Gly)和(即 Bivalirudin 多一 Gly)杂质。
技术实现思路
本专利技术旨在提供一种多肽固相合成比法卢定(Bivalirudin)的制备方法。本专利技术提供了一种比法卢定(Bivalirudin)的制备方法，所述的方法包括步骤(1)在缩合剂存在下，将Fmoc-Asn(Trt)-Gly-OH和如式V所示的多肽树脂缩合，得4到如式III所示的多肽树脂；(2)将如式III所示的多肽树脂和去保护剂混合，除去Fmoc保护基；(3)在缩合剂存在下，将Fmoc-Gly-Gly-Gly-Gly-OH和如式VI所示的多肽树脂缩 合，得到如式IV所示的多肽树脂；(4)通过固相合成的方法将氨基酸自C端向N端按照Pro至Arg至Pro至Phe的 顺序依次同如式IV所示的多肽树脂上的多肽缩合，形成如式II所示的多肽树脂；和(5)在切割剂的存在下，使式II所示多肽树脂上的多肽和树脂分离，得到如式I所 示的比法卢定； 其中，所述的Fmoc-Asn (Trt)-Gly-OH通过下述步骤得到⑴将Z-Asn (Trt) -OH和H-Gly-OBzl. TosOH混合，进行液相多肽缩合，得到 Z-Asn (Trt)-Gly-OBzl ；(ii)将 Z-Asn(Trt)-Gly-OBzl 进行氢化还原，得到 H-Asn(Trt)-Gly-OH ；禾口(iii)将 H-Asn (Trt) -Gly-OH 和 Fmoc 保护基混合，得到 Fmoc-Asn (Trt) -Gly-OH0所述的Fmoc-Gly-Gly-Gly-Gly-OH通过下述步骤得到(a)将H-Gly-Gly-OBzl和Z-Gly-Gly-OH混合，进行液相多肽缩合，得到Z-Gly-Gly-Gly-Gly-OBzl ；(b)将 Z-Gly-Gly-Gly-Gly-OBzl 进行氢化还原，得到 H_GIy-GIy-GIy-GIy-OH ；禾口(c) W H-Gly-Gly-Gly-Gly-OH 禾口 Fmoc 保护基 M 合，得至Ij Fmoc-Gly-Gly-Gly-Gly-OHo所述的H-Gly-Gly-OBzl通过将Boc-Gly-OH和H-Gly-OBzl进行液相多肽缩合后 脱保护基得到。所述的Z-Gly-Gly-OH通过将Z-Gly-OH和H-Gly-OMe进行液相多肽缩合后还原得 到。在本专利技术提供的制备方法中，所述去保护剂以其总体积计，其中含有3-20%哌啶 和0.5-10%二环脒(DBU)；优选，所述的去保护剂中还含有选自下述的一种或多种物质 0-20% 1-羟基苯并三唑(HOBt)、0-8% 3-羟基-1，2，3-苯并三嗪-4 (3H)-酮(Η00ΒΤ)在另一优选例中，所述的去保护剂含有5-15%哌啶和1-7%二环脒(DBU)；优选， 所述去保护剂还含有选自下述的一种或多种物质0. 5-10% 1-羟基苯并三唑(HOBt)、 2-5% 3-羟基-1,2,3-苯并三嗪-4 (3H)-酮 3-羟基-1,2,3-苯并三嗪 _4 (3H)-酮(Η00ΒΤ)。在本专利技术提供的制备方法的步骤⑷中，Arg同多肽树脂进行缩合时将 Fmoc-Arg(Pbf) -OH和五氟苯酚以及缩合剂混合，使Fmoc-Arg(Pbf) -OH和树脂上的多肽进 行缩合。在本专利技术提供的制备方法中，所述缩合在选自下述的一种或多种缩合剂的存在下 进行N，N，- 二异丙基碳二亚胺(DIC)、0_ (7-氮杂苯并三唑-1-基)-N，N，N' ,N'-四甲 基脲六氟磷酸(HATU)、0-(苯并三唑-1-基)-N，N, N, N-四甲基脲四氟硼酸(TBTU)/N-甲 基吗啉(NMM)或二异丙基乙胺(DIEA)、0-(苯并三唑-1-基)-N，N, N, N-四甲基脲六氟磷 酸(HBTU)/N-甲基吗啉(NMM)或二异丙基乙胺(DIEA)、(苯并三唑-1-基-氧)三吡咯烷 鳞六氟磷酸(PyBOP)、1_羟基苯并三唑(HOBt)。在本专利技术提供的制备方法中，述的缩合用茚三酮显色法(Kaiser)监控。在另一优选例中，脯氨酸(Pro)之后的缩合反应使用Chloranil and Kaiser测试 法进行监控。在本专利技术提供的制备方法的步骤(5)中，在各物质配比为95-60三氟乙酸 (TFA) 5-10三异丙基硅烷(TIS) 5-30水的切割剂存在下进行。据此，本专利技术提供了一种多肽固相合成比法卢定的新方法，其成本低廉、得到的比 法卢定纯度高，可以有效去除HPLC主峰前、后的(即Bivalirudin少一 Gly)和(即 Bivalirudin 多一 Gly)杂质。附图说明图1显示了实施例1获得的比法卢定1的HPLC检测图谱。图2显示了实施例2获得的比法卢定2的HPLC检测图谱。具体实施例方式本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种比法卢定（Ｂｉｖａｌｉｒｕｄｉｎ）的制备方法，其特征在于，所述的方法包括步骤：　　（１）将Ｆｍｏｃ－Ａｓｎ（Ｔｒｔ）－Ｇｌｙ－ＯＨ和如式Ｖ所示的多肽树脂缩合，得到如式Ⅲ所示的多肽树脂；　　（２）将如式Ⅲ所示的多肽树脂和去保护剂混合，除去Ｆｍｏｃ保护基；　　（３）将Ｆｍｏｃ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－ＯＨ和如式Ⅵ所示的多肽树脂缩合，得到如式Ⅳ所示的多肽树脂；　　（４）通过固相合成的方法将氨基酸自Ｃ端向Ｎ端按照Ｐｒｏ至Ａｒｇ至Ｐｒｏ至Ｐｈｅ的顺序依次同如式Ⅳ所示的多肽树脂上的多肽缩合，形成如式Ⅱ所示的多肽树脂；和　　（５）使式Ⅱ所示多肽树脂上的多肽和树脂分离，得到如式Ⅰ所示的比法卢定；　　＊＊＊。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：白俊才，张若平，刘亚东，张国庆，
申请(专利权)人：上海昂博生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]