【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及大麦种植领域，尤其涉及一种提高农杆菌侵染后大麦小孢子愈伤组织绿苗分化率的方法及其应用。
技术介绍
1、植物小孢子(microspore)培养属于单细胞起源、单倍体生殖细胞培养体系，通过染色体加倍植株形状可以快速纯合、稳定下来，同时也可以获得高频再生植株。目前，在烟草、油菜、玉米、辣椒等多种作物中都已建立起成熟的游离小孢子培养体系。本实验室已经在大麦上建立了小孢子培养再生体系和农杆菌介导的遗传转化体系。在小孢子培养过程中，绿苗分化率是决定小孢子高频再生的关键因素。在以往的研究中我们发现农杆菌侵染后的小孢子愈伤组织绿苗分化能力明显下降。因此，在现有的基础上进一步提升农杆菌侵染后的大麦小孢子愈伤组织绿苗分化率，能使大麦小孢子再生技术更好的服务于单倍体分子育种。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供一种可以显著提高农杆菌侵染后大麦小孢子愈伤组织绿苗分化率的方法及其应用。
2、为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：
3、本专利技术提供了一种提高农杆菌侵染后大麦小孢子愈伤组织绿苗分化率的方法，包括如下步骤：
4、(1)大麦小孢子诱导培养：
5、将大麦小孢子接种到诱导培养基中培养25～30d，得到小孢子愈伤组织；
6、(2)大麦小孢子愈伤组织继代培养：
7、将所述小孢子愈伤组织接种到固体诱导培养基中继代培养10～15d，得到继代小孢子愈伤组织；
8、(3)农杆菌侵染大麦小孢子愈
9、将所述继代小孢子愈伤组织与农杆菌菌悬液混合25～35min后，移至共培养基中共培养2～4d，得到侵染的愈伤组织；
10、(4)侵染后处理：
11、将所述侵染的愈伤组织使用负压处理后，移至分化培养基进行分化培养25～30d，得到大麦小孢子愈伤绿苗。
12、作为优选，所述诱导培养基是以n6培养基为基础，还包括如下浓度的组分：
13、80～100g/l麦芽糖、0.4～0.6mg/l 6-糠基氨基嘌呤、0.8～1.2mg/l二氯苯氧乙酸、0.960～0.980g/l 2-吗啉乙磺酸、300～500mg/l水解干酪素和1400～1800mg/l谷氨酰胺；
14、所述诱导培养基的ph为5.6～6.0。
15、作为优选，步骤(1)中，所述培养的温度为20～30℃；所述大麦小孢子培养至10～15d时更换诱导培养基；
16、步骤(2)中，所述继代培养的温度为20～30℃。
17、作为优选，所述固体诱导培养基以n6培养基为基础，还包括如下浓度的组分：
18、80～100g/l麦芽糖、0.4～0.6mg/l 6-糠基氨基嘌呤、0.8～1.2mg/l二氯苯氧乙酸、0.960～0.980g/l 2-吗啉乙磺酸、300～500mg/l水解干酪素、1400～1800mg/l谷氨酰胺和6～10g/l琼脂粉；
19、所述固体诱导培养基的ph为5.6～6.0。
20、作为优选，所述农杆菌菌悬液的制备方法包括如下步骤：
21、1)将载体转入到农杆菌菌株中，得到含有载体的农杆菌；将所述的含有载体的农杆菌接种到yeb培养基中扩繁，得到扩繁后的农杆菌；
22、2)将所述的扩繁后的农杆菌离心2～4次，得到农杆菌沉淀；
23、3)使用诱导培养基稀释农杆菌沉淀，得到农杆菌菌悬液；
24、步骤1)中，所述载体为pcambia1305.1；所述农杆菌菌株为lba4404；
25、所述yeb培养基以水为溶剂，包括如下浓度的组分：4～6g/l牛肉膏、0.5～1.5g/l酵母提取物、4～6g/l蛋白胨、4～6g/l蔗糖、0.3～0.7g/lmgso4·h2o；所述yeb培养基的ph为6.5～7.5；
26、所述扩繁后的农杆菌的od600为0.6～0.8；
27、步骤2)中，每次离心的转速为2500～3500rpm；每次离心的时间为4～6min；
28、步骤3)中，所述农杆菌菌悬液的od600为0.6～0.8；
29、所述诱导培养基以n6培养基为基础，还包括如下浓度的组分：
30、80～100g/l麦芽糖、0.4～0.6mg/l 6-糠基氨基嘌呤、0.8～1.2mg/l二氯苯氧乙酸、0.960～0.980g/l 2-吗啉乙磺酸、300～500mg/l水解干酪素、1400～1800mg/l谷氨酰胺；
31、所述诱导培养基的ph为5.6～6.0。
32、作为优选，步骤(3)中，所述继代小孢子愈伤组织与农杆菌菌悬液混合的数量体积比为150～250个：40～60ml；
33、所述共培养基是以n6培养基为基础，还包括如下浓度的组分：
34、80～100g/l麦芽糖、0.4～0.6mg/l 6-糠基氨基嘌呤、0.8～1.2mg/l二氯苯氧乙酸、0.960～0.980g/l 2-吗啉乙磺酸、80～120mg/l乙酰丁香酮、750～850mg/l l-半胱氨酸和6～10g/l琼脂粉；
35、所述共培养基的ph为5.6～6.0。
36、作为优选，所述负压处理的压强为40～80kpa；所述负压处理的次数为2～4次，所述负压处理的时间为30～180s/次。
37、作为优选，所述分化培养基是以2/3ms培养基为基础，还包括如下浓度的组分：
38、20～40g/l麦芽糖、0.3～0.7mg/l 6-苄氨基嘌呤、1.0～2.0mg/l 6-糠基氨基嘌呤、0.02～0.08mg/lα-萘乙酸、6～10g/l琼脂粉；
39、所述分化培养基的ph为5.6～6.0。
40、作为优选，步骤(3)中，所述共培养的温度为20～30℃；
41、步骤(4)中，所述分化培养的温度为20～30℃。
42、本专利技术还提供了所述的方法在大麦育种中的应用。
43、本专利技术的有益效果：
44、本专利技术针对大麦小孢子愈伤组织侵染后分化能力差的问题，提供了一种能够显著提高农杆菌侵染后大麦小孢子愈伤组织绿苗分化率的方法，使用本专利技术的方法可以使大麦小孢子愈伤组织绿苗分化率达到26.67～43.33％。
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1.一种提高农杆菌侵染后大麦小孢子愈伤组织绿苗分化率的方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述诱导培养基是以N6培养基为基础，还包括如下浓度的组分：
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述培养的温度为20～30℃；所述大麦小孢子培养至10～15d时更换诱导培养基；
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述固体诱导培养基以N6培养基为基础，还包括如下浓度的组分：
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述农杆菌菌悬液的制备方法包括如下步骤：
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述继代小孢子愈伤组织与农杆菌菌悬液混合的数量体积比为150～250个：40～60mL；
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述负压处理的压强为40～80Kpa；所述负压处理的次数为2～4次，所述负压处理的时间为30～180s/次。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述分化培养基是以2/3MS培养基为基础，还包括如下浓
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述共培养的温度为20～30℃；
10.权利要求1～9任意一项所述的方法在大麦育种中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种提高农杆菌侵染后大麦小孢子愈伤组织绿苗分化率的方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述诱导培养基是以n6培养基为基础，还包括如下浓度的组分：
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述培养的温度为20～30℃；所述大麦小孢子培养至10～15d时更换诱导培养基；
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述固体诱导培养基以n6培养基为基础，还包括如下浓度的组分：
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述农杆菌菌悬液的制备方法包括如下步骤：
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述继代小孢子愈伤组织与农杆菌菌悬液混合...
【专利技术属性】
技术研发人员：郭桂梅，李颖波，周龙华，何婷，张述伟，宗营杰，杨邦伟，刘成洪，
申请(专利权)人：上海市农业科学院，
类型：发明
国别省市：
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