【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及诺如病毒检测领域，特别涉及一种诺如病毒gi-gix亚型全基因组捕捉试剂盒及应用。
技术介绍
1、诺如病毒(norovirus，nv)是一种带有包膜的单股正链rna病毒，属于人类杯状病毒科(caliciviridae)，是成年人腹泻的第一大病原和≤5岁婴幼儿腹泻的第二大病原。它在环境中存活能力强，可在物体表面存活长达2周，在水中甚至可存活2个月以上。这一特性增加了疫情爆发的风险，尤其是通过粪口途径传播。临床上，nv感染通常导致轻度和自限性的疾病，表现为急性腹泻、发热和呕吐等症状，免疫脆弱人群症状较重，严重者可导致死亡。据估计，全球约有20％的急性胃肠炎病例与诺如病毒感染相关。疫情通常在人口密集的环境，如邮轮、学校、医院和养老院等地方爆发，但也可能在家庭和社区中传播。因此，nv对全球卫生和食品安全构成了重大挑战。
2、诺如病毒的基因组大小约为7.5至7.7kb，包括三个可读框(open reading frame，orf)。其中，orf2编码主要的衣壳蛋白(vp1)，该蛋白决定了病毒的免疫原性和抗原性，也成为其分型和分类的关键依据。vp1蛋白由高度保守的s区和变异性较大的p区组成，特别是p2区域，包括免疫识别位点和受体结合位点，使nv表现出了极高的遗传多样性。为了更准确地分类和命名不同的nv毒株，目前采用了双命名系统，同时结合rdrp区域(如gⅱ.p4)和vp1区域(如gⅱ.4)对基因型进行标识。已经发现，nv至少分为10个基因组(gⅰ至gⅹ)和8个p组。其中，gⅰ包括了9个不同的基因型(gⅰ.1至gⅰ.9
3、目前市面上针对于诺如病毒的鉴定主要有以下几种方式：
4、1、传统血清学方法：传统的对诺如病毒鉴定主要有分离病毒毒株，进行血清补体结合试验和中和试验，这种方法耗时久，且病毒分离培养有失败的可能，灵敏度不够；
5、2、常规定量pcr方法：主要以诺如病毒vp1为目标区域，根据不同分型基因核酸序列特点设计引物和探针，在特定的反应体系和反应条件下，通过扩增特异性目的片段进行分型，但是定量pcr只能鉴定vp1分型，无法进行更进一步的基因序列分析和rdrp分型且无法鉴定新的分型。比如cn108796128a提供的一种gii.8型诺如病毒基因组靶向引物和扩增方法，其是在保守区域设计了六组靶向引物和两条基因组末端测序引物，但仅针对于gii.8型诺如病毒基因组序列；cn108823331a提供了一种gii.6型诺如病毒基因组靶向引物和扩增方法，设计了仅针对于gii.6型诺如病毒基因组序列，然而不同分型的诺如病毒存在差异且不同引物套装的设计覆盖诺如病毒的不同区域，这就导致了并不能简单地将针对于不同分型的引物合并作为诺如病毒全基因测序的引物，这种方式会出现不同引物之间交叉杂交以及难以覆盖全基因组的问题。
6、3、测序技术：现用检测序列变异的技术是基于pcr结合一代测序检测1到2个基因区域的变异信息，存在低效、监测范围有限的局限，已有免培养的办法多是采用宏转录组的方法，但测序数据中存在大量的宿主的数据，存在大量的数据浪费、高成本和难以检测低丰度的病毒的局限。
7、综上所述，目前市面上缺乏针对于诺如病毒gi-gix亚型全基因组的测序和扩增方案，限制了对诺如病毒的检测和变异监测。
技术实现思路
1、本方案提供了一种诺如病毒gi-gix亚型全基因组捕捉试剂盒及应用，能从血液、拭子、感染组织等环境中提取的核酸样本中进行诺如病毒gi-gix亚型全基因组逆转录与富集扩增，得到的rna产物可用于各种分子生物学实验，包括二代和三代全基因组测序实验，以方便对诺如病毒的检测和变异监测。
2、本方案通过采用特异性引物基于多重pcr技术，对诺如病毒gi-gix亚型目标序列进行靶向富集，结合二代或三代纳米孔测序技术进行实时测序分析，可以研究诺如病毒的进化机制，包括分型检测、基因突变和选择压力等，能够更好地了解其抗性特性。诺如病毒的靶向扩增研究在疫情监测、病原体鉴定、流行病学研究、抗病毒药物研发等领域具有重要意义，有助于更深入地了解和有效应对由诺如病毒引发的疾病。
3、为实现以上目的，第一方面，本方案提供了一种诺如病毒gi-gix亚型全基因组捕捉试剂盒，包括：三组引物池，其中第一引物池内的引物含有引物序列如seq id no.1-seqid no.5所示的靶向引物；第二引物池内的引物含有引物序列如seq id no 4-seq id no.7所示的靶向引物，第三引物池内的引物含有引物序列如seq id no 8-seq id no.17所示的靶向引物。
4、具体的，第一引物池内的靶向引物序列如下表一所示：
5、表一第一引物池的靶向引物
6、 序列编号 引物名称 引物序列 seq id no.1 nv-2-1-f-1 taytatgtyarvtgyktbcarga seq id no.2 nv-2-1-f-3 gargghaagaarggbaaraacaa seq id no.3 nv-2-2-f ggyaagaarcacacwgch seq id no.4 nv-2-2-r-1 tcgacgccatcttcattca seq id no.5 nv-2-1-r-1 ckrggdganactgtraaytcwcc
7、。在本方案的实施例中，seq id no.1-seq id no.3是正向的靶向引物，引导反应中的dna合成或扩增的起始点；seq id no.4-seq id 本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种诺如病毒GI-GIX亚型全基因组捕捉试剂盒，其特征在于，包括：三组引物池，其中第一引物池内的引物含有引物序列如SEQ ID NO.1-NO.5所示的靶向引物；第二引物池内的引物含有引物序列如SEQ ID NO 4-7所示的靶向引物，第三引物池内的引物含有引物序列如SEQ ID NO 8-17所示的靶向引物。
2.根据权利要求1所述的诺如病毒GI-GIX亚型全基因组捕捉试剂盒，其特征在于，SEQID NO.1-SEQ ID NO.2的正向的靶向引物同SEQ ID NO.5的反向的靶向引物构成一组引物对，SEQ ID NO.3的正向的靶向引物同SEQ ID NO.4的反向的靶向引物构成一组引物对。
3.根据权利要求1所述的诺如病毒GI-GIX亚型全基因组捕捉试剂盒，其特征在于，SEQID NO.6的正向的靶向引物同SEQ ID NO.5的反向的靶向引物构成一组引物对，SEQ IDNO.7的正向的靶向引物同SEQ ID NO.4的反向的靶向引物构成一组引物对。
4.根据权利要求1所述的诺如病毒GI-GIX亚型全基因组捕捉试剂盒，其特征在于，S
5.根据权利要求1所述的诺如病毒GI-GIX亚型全基因组捕捉试剂盒，其特征在于，三组引物池内的引物分别对诺如病毒逆转录产物进行多重PCR扩增，且三组引物池的多重PCR扩增条件相同。
6.根据权利要求5所述的诺如病毒GI-GIX亚型全基因组捕捉试剂盒，其特征在于，多重PCR扩增条件如下表所示：
7.根据权利要求1所述的诺如病毒GI-GIX亚型全基因组捕捉试剂盒，其特征在于，第一引物池、第二引物池、第三引物池内的引物由靶向引物、UMI序列和barcdoe序列排列组成。
8.一种诺如病毒GI-GIX亚型全基因组捕捉试剂盒的应用方法，其特征在于，包括：获取待测的诺如病毒的逆转录cDNA链，分别利用第一引物池、第二引物池以及第三引物池中的引物对诺如病毒的逆转录cDNA链进行扩增得到扩增产物，将扩增产物拼接后利用测序平台测序得到诺如病毒GI-GIX亚型全基因序列，其中第一引物池内的引物含有引物序列如SEQID NO.1-NO.5所示的靶向引物；第二引物池内的引物含有引物序列如SEQ ID NO 4-7所示的靶向引物，第三引物池内的引物含有引物序列如SEQ ID NO 8-17所示的靶向引物。
9.根据权利要求8所述的如病毒GI-GIX亚型全基因组捕捉试剂盒的应用方法，其特征在于，包括：取待测诺如病毒提取RNA后加入逆转录反应预混液与逆转录引物后进行逆转录得到逆转录cDNA链。
10.根据权利要求8所述的诺如病毒GI-GIX亚型全基因组捕捉试剂盒的应用方法，其特征在于，利用二代测序平台和三代测序平台对扩增产物进行测序。
...【技术特征摘要】
1.一种诺如病毒gi-gix亚型全基因组捕捉试剂盒，其特征在于，包括：三组引物池，其中第一引物池内的引物含有引物序列如seq id no.1-no.5所示的靶向引物；第二引物池内的引物含有引物序列如seq id no 4-7所示的靶向引物，第三引物池内的引物含有引物序列如seq id no 8-17所示的靶向引物。
2.根据权利要求1所述的诺如病毒gi-gix亚型全基因组捕捉试剂盒，其特征在于，seqid no.1-seq id no.2的正向的靶向引物同seq id no.5的反向的靶向引物构成一组引物对，seq id no.3的正向的靶向引物同seq id no.4的反向的靶向引物构成一组引物对。
3.根据权利要求1所述的诺如病毒gi-gix亚型全基因组捕捉试剂盒，其特征在于，seqid no.6的正向的靶向引物同seq id no.5的反向的靶向引物构成一组引物对，seq idno.7的正向的靶向引物同seq id no.4的反向的靶向引物构成一组引物对。
4.根据权利要求1所述的诺如病毒gi-gix亚型全基因组捕捉试剂盒，其特征在于，seqid no.8的正向的靶向引物同seq id no.16的反向的靶向引物构成一组引物对，seq idno.9的正向的靶向引物同seq id no.17的反向的靶向引物构成一组引物对，seq id no.10的正向的靶向引物同seq id no.11-seqid no.12的反向的靶向引物构成一组引物对，seqid no.13的正向的靶向引物同seq id no.14-seq id no.15的反向的靶向引物构成...
【专利技术属性】
技术研发人员：毛凌峰，阮婕，王磊，雷思茹，
申请(专利权)人：杭州柏熠科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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