【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于分子生物学，尤其涉及一种用于pcr的高酶活的taq dna聚合酶及其应用。
技术介绍
1、taq dna聚合酶是一种耐热聚合酶，最初从嗜热菌thermus aquaticus中分离出来。它是分子生物学中的重要工具，广泛应用于pcr技术等领域。taq dna聚合酶全长由832个氨基酸残基组成，分子量为94 kda，主要包括三个主要结构域。位于n端第1-291位氨基酸构成了5’-3’核酸外切酶活性结构域，可应用于taqman探针的水解；第292-423位氨基酸构成了3’-5’核酸外切酶结构域，但该结构域没有活性；第424-832位氨基酸构成了5’-3’聚合酶活性结构域，该结构域的三维立体结构如同人的右手，可分为拇指区、手指区和手掌区。其中拇指区负责维持dna聚合酶与引物-模板复合物的紧密结合，进一步有助于dna聚合酶的延伸；手指区负责结合dntps；手掌区是二价金属离子结合的活性区域，负责调节结合的dntps与引物3’-oh端发生反应时周围的化学环境，从而介导和催化反应的进行。
2、pcr(聚合酶链式反应）是一种用于放大扩增特定的dna（或rna）片段的分子生物学技术，它可看作是生物体外的特殊dna复制，pcr的最大特点，是能将微量的dna大幅增加。利用dna在高温时变性会变成单链，低温时引物与单链按碱基互补配对的原则结合，再调温度至dna聚合酶最适反应温度，dna聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互补链。
3、随着技术不断革新，对pcr反应的速度、灵敏度、特异性和多重扩增能力也有了
技术实现思路
1、本专利技术的目的是提供一种高酶活的taq dna聚合酶及其应用。
2、在第一方面，本专利技术提供了一种高酶活的taq dna聚合酶。
3、本专利技术所要求保护的高酶活的taq dna酶具有如seq id no.2所示的氨基酸序列。与野生型taq dna酶的氨基酸序列相比，将第77位丙氨酸突变为缬氨酸。
4、本专利技术所要求保护的高酶活的taq dna酶具有如seq id no.3所示的氨基酸序列。与野生型taq dna酶的氨基酸序列相比，将第77位丙氨酸突变为缬氨酸，第109位丙氨酸突变为赖氨酸。
5、本专利技术所要求保护的高酶活的taq dna酶具有如seq id no.4所示的氨基酸序列。与野生型taq dna酶的氨基酸序列相比，将第77位丙氨酸突变为缬氨酸，第109位丙氨酸突变为赖氨酸，第527位脯氨酸突变为甘氨酸。
6、本专利技术所要求保护的高酶活的taq dna酶具有如seq id no.5所示的氨基酸序列。与野生型taq dna酶的氨基酸序列相比，将第77位丙氨酸突变为缬氨酸，第109位丙氨酸突变为赖氨酸，第621位组氨酸突变为亮氨酸。
7、进一步地，所述野生型的taq dna聚合酶的氨基酸序列如seq id no.1所示。
8、在第二方面，本专利技术提供了一种核酸分子，所述核酸分子编码如第一方面所述的高酶活的taq dna聚合酶。
9、在第三方面，本专利技术提供了一种重组表达载体，所述重组表达载体含有如第二方面所述的核酸分子。所述重组表达载体可以选自pbr322质粒、puc系列质粒或pet系列质粒。
10、进一步地，所述重组表达载体可以选自pet-28a(+)。
11、在第四方面，本专利技术提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞包含如第二方面所述的核酸分子或如第三方面所述的重组表达载体。
12、所述宿主细胞可以选自酵母、细菌或真菌。进一步地，所述宿主细胞可以选自大肠杆菌。
13、进一步地，所述大肠杆菌可以选自大肠杆菌bl21(de3)、大肠杆菌rosetta或大肠杆菌origamib(de3)。
14、在第五方面，本专利技术提供了一种聚合酶试剂，所述聚合酶试剂中含有如第一方面所述的高酶活的taq dna聚合酶。
15、在第六方面，本专利技术提供了制备如第一方面所述高酶活的taq dna酶的方法，其制备步骤包括：在适宜的培养基中培养如第四方面所述的宿主细胞诱导表达，并分离纯化得到所述高酶活的taq dna聚合酶。
16、在第七方面，本专利技术提供了如第一方面所述的高酶活的taq dna聚合酶或如第五方面所述的聚合酶试剂在扩增dna样本中的应用。
17、本专利技术的有益效果：
18、本专利技术提供了一种高酶活的taq dna聚合酶。实验结果显示，通过在野生型taqdna酶氨基酸序列中引入a77v、a77v/a109k、a77v/a109k/p527g、a77v/a109k/h621l突变位点，使得其聚合酶活性得以显著提高。将含有本专利技术的高酶活的taq dna聚合酶的聚合酶试剂应用于扩增dna样本可以更好地满足科学研究和实际应用的需求。
本文档来自技高网...【技术保护点】
1.一种高酶活的Taq DNA聚合酶，其特征在于，所述高酶活的Taq DNA聚合酶的氨基酸序列如SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4或SEQ ID No.5所示。
2.一种核酸分子，其特征在于，其编码如权利要求1所述的高酶活的Taq DNA聚合酶。
3.一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体含有如权利要求2所述的核酸分子。
4.根据权利要求3所述的重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体为pET-28a(+)。
5.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞含有权利要求2所述的核酸分子或权利要求3-4任一项所述的重组表达载体。
6.根据权利要求5所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为大肠杆菌。
7.根据权利要求6所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为大肠杆菌BL21(DE3)、大肠杆菌Rosetta或大肠杆菌OrigamiB(DE3)。
8.一种聚合酶试剂，其特征在于，所述聚合酶试剂中含有如权利要求1所述的高酶活的Taq DNA聚合酶。
10.如权利要求1所述的高酶活的Taq DNA聚合酶或如权利要求8所述的聚合酶试剂在扩增DNA样本中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种高酶活的taq dna聚合酶，其特征在于，所述高酶活的taq dna聚合酶的氨基酸序列如seq id no.2、seq id no.3、seq id no.4或seq id no.5所示。
2.一种核酸分子，其特征在于，其编码如权利要求1所述的高酶活的taq dna聚合酶。
3.一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体含有如权利要求2所述的核酸分子。
4.根据权利要求3所述的重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体为pet-28a(+)。
5.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞含有权利要求2所述的核酸分子或权利要求3-4任一项所述的重组表达载体。
6.根据权利要求5所...
【专利技术属性】
技术研发人员：吕敬章，赵芳，金晓蕾，牛娜，麻丽丹，
申请(专利权)人：深圳市检验检疫科学研究院，
类型：发明
国别省市：
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