【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物医药领域，具体涉及能增强抗原提呈效果的核酸分子、融合蛋白及其疫苗和应用，尤其是mrna疫苗。
技术介绍
1、mrna疫苗是一种全新的疫苗，具有通用度高、效力高、构建快、容易扩大生产等优点，具有重要的临床价值和应用前景。新兴的核酸疫苗(mrna或dna)作为应急疫苗则具有非常明显的时效性优势。事实上，利用mrna疫苗来诱导机体产生抗肿瘤免疫效应已显示出巨大的潜力，并已有多项研究成果进入了临床试验阶段。mrna肿瘤疫苗是将肿瘤抗原以mrna形式导入患者体内，通过肿瘤抗原刺激患者体内t细胞，激活患者自身特异性细胞免疫的肿瘤治疗方法。目前，mrna肿瘤疫苗尚无上市产品，但在全球已有19项临床试验注册，最快的已处于临床ⅱ期阶段。尽管如此，现有的mrna肿瘤疫苗在增强抗原提呈效率和t细胞免疫应答方面仍需优化提升，尤其是在mrna序列设计与合成、翻译效率与稳定性、抗原提呈效率、t细胞免疫应答强度等方面，以进一步提高抗肿瘤免疫治疗活性，加速临床转化。
2、mrna肿瘤疫苗主要通过抗原提呈细胞(apc)的翻译机制，将mrna翻译成目标抗原蛋白，其中一些抗原蛋白会经过蛋白酶体降解途径发生泛素化降解，从而产生大量的具有抗原表位的抗原肽。这些抗原肽通过抗原处理转运蛋白(tap)被转运到内质网(er)，并被n端氨基肽酶erap1和erap2修饰，然后负载到mhc-i类蛋白上，进一步转运到细胞表面，并被抗原特异性cd8+t细胞识别，从而将抗原表位信息提呈给cd8+t细胞。或者，分泌的抗原蛋白质可以被位于组织中或淋巴结中的专职抗
3、为了有效地诱导适应性免疫反应，在抗原提呈细胞内(尤其是dc细胞)翻译后的抗原需要通过mhc-i类和mhc-ii类分子来进行抗原呈递。因而抗原提呈过程是影响mrna疫苗的免疫效果的一个重要因素。所有内源性蛋白都受mhc-i类抗原递呈的影响，只有一部分细胞内抗原被mhc-ii类分子提呈。然而，mhc-i类抗原的递呈过程通常并不高效，即使是对高亲和力的mhc-i类配体,也只有万分之一的抗原肽被递呈。因此，实现mhc-i类和mhc-ii类抗原的高效提呈对于mrna疫苗的开发具有重要意义。目前常见的策略包括将mhc分子与抗原共递送或者将抗原靶向mhc分子从而增强提呈效率。据报道，联合应用编码hpv-16e7的dna分子和编码异种mhc分子的dna疫苗可以增强交叉递呈机制，显著增强e7特异性免疫反应和抗肿瘤效应。
4、抗原的加工和提呈的一系列步骤都会影响提呈到细胞表面的表位/mhc复合物的量。除了利用mhc-i和mhc-ii类分子增强抗原提呈外，增加降解的具有抗原表位的抗原肽的分子数量也是增强抗原提呈的一种重要有效手段。大多数mhc-i类抗原肽一般通过蛋白酶体依赖的方式产生。增加抗原蛋白酶体依赖的降解策略已被证明可以改善抗原的mhc-i类呈递，从而增强e7特异性cd8+t细胞免疫反应，显著提高疫苗的效力。因此，靶向蛋白酶体增加抗原蛋白酶体降解可能为核酸药物开发提供一个全新途径。
技术实现思路
1、为解决现有技术存在的问题，本专利技术提供一种用于增强抗原提呈效果的疫苗设计策略，应用于核酸、蛋白及多肽疫苗的结构序列设计及其制备，为促进疫苗的免疫效力提供一个新的途径，为新型治疗手段的研发提供新的思路。
2、本专利技术是基于专利技术人的下列专利技术工作而提出的：
3、以ova作为模式抗原蛋白，选择三种e3连接酶mdm2、vhl和keap1的肽类配体与之偶联，包括pmi、vhl ligand(以下简称为vhll)和keap1的结合元件(以下简称为keap1b)。同时还根据mdm2结合抑癌蛋白p53的蛋白复合体结构特征，选择了p53的螺旋残基的17-26位作为e3连接酶配体(以下简称为p53b)，并进一步验证了e3泛素酶连接酶的结合或招募配体可增强ova抗原蛋白在细胞内的蛋白酶体途径降解，提高mrna肿瘤疫苗的抑瘤作用和抗肿瘤活性。本专利技术的技术方案可进一步应用于其他mrna肿瘤疫苗的设计，并在多种肿瘤模型中研究证实其促进抗原递呈效能和发挥激活特异性t细胞对肿瘤细胞的杀伤作用，实现高效的肿瘤免疫治疗的效果。本专利技术的技术方案还可进一步应用于预防性mrna疫苗的设计，以获得增强的免疫原性。
4、一方面，本专利技术提供一种核酸分子。
5、所述核酸分子的开放阅读框至少包含一个抗原元件，和至少一个e3配体元件，所述e3配体元件是e3泛素酶连接酶的结合或招募配体。
6、所述核酸分子中的e3泛素酶连接酶任选自vhl(von hippel-lindau)、mdm2、crbn、iaps、rnf、β-trcp、dcaf、keap1或其截短体或其延长体中的一种或多种；
7、进一步地，所述e3泛素酶连接酶选自ring型、hect型和rbr型；
8、进一步地，所述核酸分子中的e3泛素酶连接酶优选为vhl(von hippel-lindau)、mdm2、β-trcp、keap1或其截短体或其延长体中的一种或多种；
9、进一步地，所述e3泛素酶连接酶的结合或招募配体与一种或多种e3泛素酶连接酶结合。
10、进一步地，所述keap1，结合或招募配体对应的氨基酸序列是ldpetgeyl或与其同源性大于60％的序列。
11、进一步地，所述β-trcp，结合或招募配体对应的氨基酸序列是drhdsgldsm或与其同源性大于60％的序列。
12、进一步地，所述vhl，结合或招募配体对应的氨基酸序列是lap(oh)yi或alapyip中的至少一种，或与其同源性大于60％的序列。
13、进一步地，所述mdm2，结合或招募配体对应的氨基酸序列是etfsdlwkll、tsfaeywnllsp、ltfehywaqlts、tnwyanlekllr、tawyanfekllr、dwwplafeallr、cnckapetalcarrcqqh或cnckapetflcywrclqh中的一种或多种，或与其同源性大于60％的序列。
14、进一步地，上述核酸分子，所述抗原元件与e3配体元件是以e3配体元件-抗原元件、抗原元件-e3配体元件、e3配体元件-抗原元件-e3配体元件或抗原元件-e3配体元件-抗原元件中的任一形式连接。
15、进一步地，所述抗原元件与e3配体元件通过linker连接；
16、其中，所述linker的氨基酸序列为ggggs、(ggggs)3、(ggggs)6、本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种核酸分子，其包含至少一个开放阅读框，其特征在于，所述开放阅读框至少包含一个抗原元件，和至少一个E3配体元件；其中，所述E3配体元件是E3泛素酶连接酶的结合或招募配体；所述E3泛素酶连接酶的结合或招募配体与一种或多种E3泛素酶连接酶结合。
2.根据权利要求1所述的核酸分子，其特征在于，所述E3泛素酶连接酶选自RING型、HECT型和RBR型。
3.根据权利要求1所述的核酸分子，其特征在于，所述E3泛素酶连接酶任选自VHL(VonHippel-Lindau)、MDM2、CRBN、IAPs、RNF、β-TrCP、DCAF、Keap1或其截短体或其延长体中的一种或多种；
4.根据权利要求1～3任一项所述的核酸分子，其特征在于，所述抗原元件与E3配体元件是以E3配体元件-抗原元件、抗原元件-E3配体元件、E3配体元件-抗原元件-E3配体元件或抗原元件-E3配体元件-抗原元件中的任一形式连接；其中，所述抗原元件与E3配体元件通过linker连接。
5.根据权利要求4所述核酸分子，其特征在于，所述linker的氨基酸序列为GGGGS、(G
6.根据权利要求1～3任一项所述核酸分子，其特征在于，所述抗原元件包括有至少一个抗原表位。
7.根据权利要求6所述核酸分子，其特征在于，所述抗原表位是T细胞抗原决定簇或T细胞抗原表位。
8.根据权利要求6所述核酸分子，其特征在于，所述抗原表位来源于肿瘤的抗原表位肽、自身免疫疾病的抗原表位肽或病原微生物的抗原表位肽；其中，所述肿瘤的抗原或抗原表位肽任选自由基因突变引起的抗原，和/或组织特异性分化抗原，和/或过表达抗原，和/或癌-睾丸抗原，和/或通用抗原，和/或致癌病毒源性抗原；
9.根据权利要求1～3任一项所述核酸分子，其特征在于，所述核酸分子包含信号肽编码区。
10.根据权利要求1～3任一项所述核酸分子，其特征在于，所述核酸分子包含启动子、5’端非翻译区、3’端非翻译区和polyA。
11.根据权利要求1～3、5、7～8任一项所述核酸分子，其特征在于，所述核酸选自DNA、ASO、siRNA、miRNA、mRNA、适配体中至少一种。
12.一种核酸疫苗，其特征在于，包含：
13.根据权利要求12所述核酸疫苗，其特征在于，所述纳米载体包括选自脂质体、纳米粒、微球和脂质纳米载体中的至少之一。
14.根据权利要求13所述核酸疫苗，其特征在于，所述纳米载体是采用以下至少一种脂质材料制备而成：
15.根据权利要求12所述核酸疫苗，其特征在于，所述mRNA疫苗是采用微流控设备将所述mRNA和脂质材料自组装形成；或者
16.一种蛋白，其特征在于，所述蛋白是由权利要求1～11任一项所述核酸分子编码形成的。
17.一种蛋白或多肽疫苗，其特征在于，包含：权利要求16所述蛋白作为抗原成分；还
18.根据权利要求17所述蛋白或多肽疫苗，其特征在于，所述免疫佐剂包括选自弗氏不完全佐剂、完全弗氏佐剂、氢氧化铝佐剂、磷酸铝佐剂、乳佐剂、脂质体佐剂和微生物佐剂中的一种或多种。
19.一种载体，其特征在于，携带权利要求1～11任一项所述核酸分子；其中，所述载体为真核载体或原核载体。
20.根据权利要求19所述载体，其特征在于，所述载体包括选自质粒载体、腺病毒载体、慢病毒载体和腺相关病毒载体中一种或多种。
21.载体疫苗，其特征在于，包括活性成分；所述活性成分是通过将权利要求1～11任一项所述的核酸分子装载到权利要求19～20任一项所述载体得到的。
22.一种药物组合物，其特征在于，包括：
23.权利要求1～11任一项所述核酸分子、权利要求12～15任一项所述核酸疫苗、权利要求16所述蛋白、权利要求17～18任一项所述的蛋白或多肽疫苗或权利要求21所述的载体疫苗、权利要求22所述药物组合物在制备预防或治疗相关疾病中的药物中的用途。
...【技术特征摘要】
1.一种核酸分子，其包含至少一个开放阅读框，其特征在于，所述开放阅读框至少包含一个抗原元件，和至少一个e3配体元件；其中，所述e3配体元件是e3泛素酶连接酶的结合或招募配体；所述e3泛素酶连接酶的结合或招募配体与一种或多种e3泛素酶连接酶结合。
2.根据权利要求1所述的核酸分子，其特征在于，所述e3泛素酶连接酶选自ring型、hect型和rbr型。
3.根据权利要求1所述的核酸分子，其特征在于，所述e3泛素酶连接酶任选自vhl(vonhippel-lindau)、mdm2、crbn、iaps、rnf、β-trcp、dcaf、keap1或其截短体或其延长体中的一种或多种；
4.根据权利要求1～3任一项所述的核酸分子，其特征在于，所述抗原元件与e3配体元件是以e3配体元件-抗原元件、抗原元件-e3配体元件、e3配体元件-抗原元件-e3配体元件或抗原元件-e3配体元件-抗原元件中的任一形式连接；其中，所述抗原元件与e3配体元件通过linker连接。
5.根据权利要求4所述核酸分子，其特征在于，所述linker的氨基酸序列为ggggs、(ggggs)3、(ggggs)6、(ggs)10或(gsg)10中的至少一种。
6.根据权利要求1～3任一项所述核酸分子，其特征在于，所述抗原元件包括有至少一个抗原表位。
7.根据权利要求6所述核酸分子，其特征在于，所述抗原表位是t细胞抗原决定簇或t细胞抗原表位。
8.根据权利要求6所述核酸分子，其特征在于，所述抗原表位来源于肿瘤的抗原表位肽、自身免疫疾病的抗原表位肽或病原微生物的抗原表位肽；其中，所述肿瘤的抗原或抗原表位肽任选自由基因突变引起的抗原，和/或组织特异性分化抗原，和/或过表达抗原，和/或癌-睾丸抗原，和/或通用抗原，和/或致癌病毒源性抗原；
9.根据权利要求1～3任一项所述核酸分子，其特征在于，所述核酸分子包含信号肽编码区。
10.根据权利要求1～3任一项所述核酸分子，其特征在于，所述...
【专利技术属性】
技术研发人员：请求不公布姓名，请求不公布姓名，请求不公布姓名，请求不公布姓名，
申请(专利权)人：成都威斯津生物医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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