【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及用于生产包含至少一个发夹的脱氧核糖核苷酸(dna)的体外无细胞方法、对应的dna产物及其用途、以及在本专利技术的方法中有用的寡核苷酸和试剂盒。
技术介绍
1、用于从开始模板扩增闭合线性dna的体外无细胞方法已经描述在wo2010/086626和wo2012/017210中。希望提供其它方法，其可以合成闭合线性dna，且其也允许合成其它类型的包含一个或多个发夹的dna分子。
技术实现思路
1、本专利技术提供了用于合成包含一个或更多个发夹的dna分子的方法，所述方法不需要使用任何微生物步骤来提供开始模板。所述方法也允许合成包含一个或多个发夹的环形单链dna或双链dna。这些产物包括这样的dna分子：专利技术人认为其具有以前在本领域中没有描述的结构，且其具有用于宽范围的应用的优点。
2、根据本专利技术，在体外无细胞方法中进行包含发夹的dna分子的合成，所述方法从可以在所述方法的全部或部分中固定化至固体支持物的寡核苷酸开始。使用可以化学地合成的短模板寡核苷酸酶促地延伸所述寡核苷酸以合成所需dna序列，从而避免使用通常需要在细菌中增殖的编码整个所需序列的大开始模板。一旦合成了所需dna序列，它就可以以包含一个或多个发夹的单链或双链形式从固体支持物释放。
3、有利地，用于在本专利技术的dna分子中提供发夹的序列也会提供在dna合成结束后合成的dna从固体支持物的酶促释放方式。将一种寡核苷酸固定化到固体支持物上并延伸以引入所需dna序列从而建立第一dna链，
4、在其它方面，本专利技术提供了通过建立完整原核端粒酶靶序列或能够在合成的dna链的远侧延伸区域中形成发夹的其它序列而向产生的dna分子添加第二闭合末端发夹。这样的能够形成发夹的序列可以包括邻近互补序列或被非互补的序列隔开的两个互补序列。
5、在其它方面，本专利技术提供了通过建立完整原核端粒酶靶序列或能够在合成的dna链中形成发夹的其它序列而向产生的单链dna分子添加第三、第四、第五或更多闭合末端发夹。
6、根据本专利技术合成的dna分子可以用于多种应用，包括医学和诊断用途，以及用作其它dna扩增方法的开始模板。
7、更详细地，本专利技术提供了：
8、在第一方面，用于生产包含所需dna序列的脱氧核糖核酸(dna)的体外无细胞方法，所述方法包括：
9、(a)使固定化在固体支持物上的寡核苷酸在有至少一种dna聚合酶存在下在促进所述固定化的寡核苷酸的模板依赖性延伸的条件下与一系列在序列上重叠的模板寡核苷酸接触以产生第一dna链，该链包含所需dna序列且进一步包含所述在固体支持物近侧的原核端粒酶靶序列的第一部分；
10、(b)在(a)所产生的所述第一dna链的远侧部分中或在第二或其它链上引入包含(a)的原核端粒酶靶序列的第二部分的dna序列，使得所述原核端粒酶靶序列的第一部分和第二部分由此建立在所述固体支持物近侧的(a)的原核端粒酶的完整靶序列；和
11、(c)使在所述固体支持物近侧的所述完整原核端粒酶靶序列在促进所述靶序列的切割和重连的条件下与原核端粒酶接触，由此从固定释放产生的dna。
12、在一个实施方案中，所述原核端粒酶靶序列的第一部分和第二部分是在序列上互补的。
13、在另一个方面，本专利技术涉及包含固定化的寡核苷酸的固体支持物，所述寡核苷酸包含原核端粒酶的靶序列的第一部分。
14、在另一个方面，本专利技术涉及试剂盒，其包含含有原核端粒酶的靶序列的第一部分的寡核苷酸、一系列模板寡核苷酸和任选的关于在本专利技术的方法中使用的说明书。
15、在第四方面，本专利技术涉及包含一个或多个发夹的单链环形dna，所述发夹中的至少一个包含原核端粒酶的靶序列的一部分。
16、在第五方面，本专利技术涉及包含第一发夹和第二发夹的线性共价闭合双链dna，所述第一发夹包含第一原核端粒酶的靶序列的一部分，所述第二发夹具有不与所述第一发夹互补的序列。在一个实施方案中，这由包含第二原核端粒酶的靶序列的一部分的第二发夹实现，其中所述第一和第二原核端粒酶是不同的。在一个替代实施方案中，这由包含能够形成发夹的序列的第二发夹实现。这样的序列可以包括能够彼此退火的邻近的或分离的互补序列。
17、在第六方面，本专利技术涉及用于扩增dna的体外无细胞方法，所述方法包括使单链环形dna模板在有一种或多种引物存在下在促进所述模板扩增的条件下与至少一种dna聚合酶接触，所述dna模板包含含有原核端粒酶的靶序列的一部分的发夹。
18、在第七方面，本专利技术涉及用于生产线性共价闭合脱氧核糖核酸(dna)的体外无细胞方法，所述方法包括：
19、(a)使包含第一发夹和第二发夹的线性共价闭合双链dna在促进dna扩增的条件下与dna聚合酶接触，所述第一发夹包含第一原核端粒酶的靶序列的一部分，所述第二发夹包含第二原核端粒酶的靶序列的一部分，和
20、(b)使所述扩增的dna在促进线性共价闭合dna的产生的条件下与所述第一和第二原核端粒酶接触，
21、其中所述第一和第二原核端粒酶是不同的。
22、在第八方面，本专利技术涉及包含至少一个发夹的单链环形dna，所述发夹含有原核端粒酶的靶序列的一部分，所述dna用于用在治疗或诊断中，特别是用于用在治疗人或动物体的方法中，或用在在人或动物体上实施的诊断方法中。
23、在第九方面，本专利技术涉及包含至少一个发夹的线性共价闭合双链dna，所述发夹包含第一原核端粒酶的靶序列的一部分，且其中第二发夹的序列不与第一发夹的序列互补，所述dna用在治疗或诊断中，特别是用于用在治疗人或动物体的方法中，或用在在人或动物体上实施的诊断方法中。在一个实施方案中，所述第二发夹包含第二原核端粒酶的靶序列的一部分，其中所述第一和第二原核端粒酶是不同的。在一个替代实施方案中，所述第二发夹由邻近的或分离的互补序列提供。
24、在第十方面，本专利技术涉及治疗人或动物体的方法，所述方法包括给有此需要的人或动物施用治疗有效量的包含发夹的单链环形dna，所述发夹含有原核端粒酶的靶序列的一部分。
25、在第十一方面，本专利技术涉及治疗人或动物体的方法，所述方法包括给有此需要的人或动物施用治疗有效量的包含至少一个发夹的线性共价闭合双链dna，所述发夹包含第一原核端粒酶的靶序列的一部分，且其中第二发夹的序列不与第一发夹的序列互补。在一个实施方案中，所述第二发夹包含第二原核端粒酶的靶序列的一部分，其中所述第一和第二原核端粒酶是不同的。在一本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种单链环形DNA，其包含一个或多个发夹，所述发夹中的至少一个包含原核端粒酶的靶序列的一部分。
2.根据权利要求1所述的单链环形DNA，所述单链环形DNA包含第二发夹，所述第二发夹包含：
3.根据权利要求1或权利要求2所述的单链环形DNA，所述单链环形DNA包含一个或多个适体，任选地，其中适体被包含在发夹环中。
4.根据权利要求1至3任一项所述的单链环形DNA，所述单链环形DNA还包含至少一个内切核酸酶位点。
5.一种线性共价闭合双链DNA，其包含第一发夹和第二发夹，所述第一发夹包含第一原核端粒酶的靶序列的一部分，所述第二发夹包含：
6.根据权利要求5所述的线性共价闭合双链DNA，其中所述第一和第二原核端粒酶选自以下中的两种：SEQ ID NO:10的细菌噬菌体N15 TelN或其变体、SEQ ID NO:12的根癌土壤杆菌TelA或其变体和SEQ ID NO:14的副溶血弧菌质粒Vp58.5或其变体。
7.一种扩增DNA的体外无细胞方法，所述方法包括使单链环形DNA模板在有一种或多种引物存在下、在促进所
8.根据权利要求7所述的方法，所述方法产生扩增的DNA，所述DNA包含含有扩增的DNA序列的重复单元的多联体。
9.一种多联体DNA，其包含DNA模板的多个重复，其中所述DNA模板是具有至少一个发夹的单链环形DNA，所述发夹包含原核端粒酶的靶序列的一部分。
...【技术特征摘要】
1.一种单链环形dna，其包含一个或多个发夹，所述发夹中的至少一个包含原核端粒酶的靶序列的一部分。
2.根据权利要求1所述的单链环形dna，所述单链环形dna包含第二发夹，所述第二发夹包含：
3.根据权利要求1或权利要求2所述的单链环形dna，所述单链环形dna包含一个或多个适体，任选地，其中适体被包含在发夹环中。
4.根据权利要求1至3任一项所述的单链环形dna，所述单链环形dna还包含至少一个内切核酸酶位点。
5.一种线性共价闭合双链dna，其包含第一发夹和第二发夹，所述第一发夹包含第一原核端粒酶的靶序列的一部分，所述第二发夹包含：
6.根据权利要求5所述的线性共价闭合双链dna，其中所述第一和第二原核端粒酶选自以下中的两...
【专利技术属性】
技术研发人员：保罗·罗斯韦尔，尼尔·波特，L·瓦伊尼，T·艾迪，
申请(专利权)人：塔驰莱特IP有限公司，
类型：发明
国别省市：
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