【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于分子生物学，具体涉及一种基于绿鳍马面鲀转录组测序获得的评估绿鳍马面鲀种群遗传多样性的ssr标记引物、方法及其在群体遗传多样性分析中的应用。
技术介绍
1、绿鳍马面鲀（ thamnaconus septentrionalis）隶属鲀形目（tetraodontiformes）、单角鲀科（monacanthidae）、马面鲀属（ thamnaconus），主要分布在中日韩附近海域，因肉质鲜嫩、营养丰富而深受人们的喜爱，具有很高的经济价值。绿鳍马面鲀曾是我国和韩国的主要捕捞对象，最高年产量都超过32万吨。但由于过度捕捞和产卵场生态环境受到破坏等原因，绿鳍马面鲀的种群资源锐减，渔业捕捞已不能满足正常的市场需求，价格不断攀升。目前，绿鳍马面鲀的研究主要集中在资源评估和分布、苗种繁育及养殖技术、群体遗传结构和遗传多样性分析等方面，只有少量涉及微卫星标记开发及群体遗传学的研究报道。对我国绿鳍马面鲀开展遗传多样性研究可了解其主要产地的资源状况，为其人工养殖及品种培育提供理论依据，为分子标记辅助育种打下基础。
2、简单重复序列（simple sequence repeats，ssr），即微卫星标记。微卫星标记是由核心序列和侧翼序列组成，核心序列由1-6个核苷酸组成单元，单元重复次数不低于5次的简单重复序列。ssr广泛分布于真核生物基因组和转录组中，因此成为真核生物基因组水平遗传多样性评估的有效方法。ssr是共显性标记，可直接反应物种的遗传信息。由
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供一种评估绿鳍马面鲀种群遗传多样性的ssr标记引物，该引物扩增稳定，多态性强，杂合度高。
2、本专利技术的目的还在于提供一种评估绿鳍马面鲀群体遗传多样性的方法，该方法准确度高。
3、本专利技术的最后一个目的在于提供上述引物或方法在绿鳍马面鲀种群遗传多样性分析、品种鉴定、遗传图谱构建或分子辅助育种方面的应用。
4、本专利技术的上述第一个目的是通过以下技术方案来实现的：一种评估绿鳍马面鲀种群遗传多样性的ssr标记引物，其特殊之处在于：所述引物包括10对，分别为引物对1、引物对2、引物对3、引物对4、引物对5、引物对6、引物对7、引物对8、引物对9和引物对10，所述引物对1-10的核苷酸序列分别如seq id no：1~20所示。
5、10对引物的序列具体如下所示：
6、引物对1：
7、f: aggaagcaacctgaagcctc；
8、r: ttgcatgttgttctgctgcc。
9、引物对2：
10、f: agcgagatagcgaagacagc；
11、r: aggtagacaagccctgggaa。
12、引物对3：
13、f: caaagagaaagctgcgcgtt；
14、r: ttcgtccatacacacgcaca。
15、引物对4：
16、f: cgattgatttgagcggccag；
17、r: ccacccagttcaacgcaaag。
18、引物对5：
19、f: ctggagggccaatcagagtg；
20、r: cctgatcatccctagcagcg。
21、引物对6：
22、f: caacaggagtcagcaggagg；
23、r: gcttgttgatgggtgccaag。
24、引物对7：
25、f: ccgctttgcttcatggcttt；
26、r: ctgtttgggacttcacagaaca。
27、引物对8：
28、f: gtctggtgtcactgacccag；
29、r: gtggccagtgggagaactac。
30、引物对9：
31、f: actgacatgtccacagcacc；
32、r: tgtggggatcattcacctgc。
33、引物对10：
34、f: tgaagccggcagagaaacat；
35、r: gcgcaatcagctcgtttctt。
36、本专利技术的上述第二个目的是通过以下技术方案来实现的：一种评估绿鳍马面鲀群体遗传多样性的方法，其特殊之处在于：包括以下步骤：
37、（1）绿鳍马面鲀微卫星标记开发
38、取绿鳍马面鲀脑、肾、肝脏、性腺和肌肉的新鲜组织，提取组织rna，进行转录组测序，从下机数据中提取高质量序列，使用软件misa对转录组序列的编码区进行搜索，寻找微卫星标记；
39、（2）绿鳍马面鲀多态性微卫星标记筛选
40、用步骤（1）预测的微卫星标记，通过pcr扩增，电泳检测扩增产物大小，收集数据，用软件分析ssr的遗传学参数，筛选得到上述的10对特异性扩增、高多态性的ssr标记引物；
41、（3）绿鳍马面鲀遗传多样性分析
42、收集绿鳍马面鲀群体样本，提取个体dna，分别利用转录组开发的步骤（2）中的10对多态性ssr标记引物对绿鳍马面鲀群体进行pcr扩增，毛细管电泳进行基因分型，读取毛细管电泳数据，利用软件fstat2.9.3分析部分ssr标记分别在绿鳍马面鲀群体中的等位基因数（na）、期望杂合度（he）、观测杂合度（ho）、近交系数（f）和哈代温伯格平衡显著性（p），利用软件cervus计算各ssr标记在所有个体的多态信息含量（pic），利用mega软件的upgma算法对绿鳍马面鲀群体进行聚类分析。
43、在上述评估绿鳍马面鲀群体遗传多样性的方法中：
44、优选的，步骤（1）中采用trizol-氯仿法提取组织rna。
45、优选的，步骤（1）中在转录组编码区开发微卫星标记。
46、优选的，步骤（2）中筛选10对微卫星引物的过程是：根据转录组测序预测的微卫星标记，合成引物，并分别对8个绿鳍马面鲀个体进行pcr扩增，筛选出扩增稳定、多态性强、杂合度高的10对微卫星引物。<本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种评估绿鳍马面鲀种群遗传多样性的SSR标记引物，其特征在于：所述引物包括10对，分别为引物对1、引物对2、引物对3、引物对4、引物对5、引物对6、引物对7、引物对8、引物对9和引物对10，，所述引物对1-10的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：1~20所示。
2.一种评估绿鳍马面鲀群体遗传多样性的方法，其特征在于：包括以下步骤：
3.根据权利要求2所述的一种评估绿鳍马面鲀群体遗传多样性的方法，其特征在于：所述步骤（1）中采用Trizol-氯仿法提取组织RNA。
4.根据权利要求2所述的一种评估绿鳍马面鲀群体遗传多样性的方法，其特征在于：步骤（1）中在转录组编码区开发微卫星标记。
5.根据权利要求2所述的一种评估绿鳍马面鲀群体遗传多样性的方法，其特征在于：步骤（2）中筛选10对微卫星引物的过程是：根据转录组测序预测的微卫星标记，合成引物，并分别对8个绿鳍马面鲀个体进行PCR扩增，筛选出扩增稳定、多态性强、杂合度高的10对微卫星引物。
6.根据权利要求2所述的一种评估绿鳍马面鲀群体遗传多样性的方法，其特征在于：步骤（
7.根据权利要求2所述的一种评估绿鳍马面鲀群体遗传多样性的方法，其特征在于：步骤（2）中PCR反应程序设定为：94 ℃预变性5 min，然后94 ℃变性30 s，48-60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30s，共35个循环，最后72 ℃延伸10 min。
8.根据权利要求2所述的一种评估绿鳍马面鲀群体遗传多样性的方法，其特征在于：步骤（3）中在10对多态性SSR标记引物的5’端标记FAM荧光基团。
9.根据权利要求2所述的一种评估绿鳍马面鲀群体遗传多样性的方法，其特征在于：步骤（3）采用ABI 3730XL进行基因型分型，利用Gene mapper v4.0读取个体等位基因大小（bp），利用软件FSTAT2.9.3分析10对SSR标记引物分别在绿鳍马面鲀群体中的等位基因数（Na）、期望杂合度（He）、观测杂合度（Ho）和哈代温伯格平衡显著性（P）等遗传参数。
10.权利要求1所述SSR标记引物或权利要求2-8任一项所述方法在绿鳍马面鲀种群遗传多样性分析、品种鉴定、遗传图谱构建或分子辅助育种方面的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种评估绿鳍马面鲀种群遗传多样性的ssr标记引物，其特征在于：所述引物包括10对，分别为引物对1、引物对2、引物对3、引物对4、引物对5、引物对6、引物对7、引物对8、引物对9和引物对10，，所述引物对1-10的核苷酸序列分别如seq id no：1~20所示。
2.一种评估绿鳍马面鲀群体遗传多样性的方法，其特征在于：包括以下步骤：
3.根据权利要求2所述的一种评估绿鳍马面鲀群体遗传多样性的方法，其特征在于：所述步骤（1）中采用trizol-氯仿法提取组织rna。
4.根据权利要求2所述的一种评估绿鳍马面鲀群体遗传多样性的方法，其特征在于：步骤（1）中在转录组编码区开发微卫星标记。
5.根据权利要求2所述的一种评估绿鳍马面鲀群体遗传多样性的方法，其特征在于：步骤（2）中筛选10对微卫星引物的过程是：根据转录组测序预测的微卫星标记，合成引物，并分别对8个绿鳍马面鲀个体进行pcr扩增，筛选出扩增稳定、多态性强、杂合度高的10对微卫星引物。
6.根据权利要求2所述的一种评估绿鳍马面鲀群体遗传多样性的方法，其特征在于：步骤（2）中pcr扩增时，反应体系为10 μl：2×pcr mix 5 μl，浓度为10 ...
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