【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因编辑，尤其是涉及一种安全性高的碱基编辑器及其构建方法与应用。
技术介绍
1、crispr/cas9为代表的新型基因编辑技术在编辑效率方面具有优势，有效推动了基因编辑技术的发展和进步。2016年以来，研究者以crispr/cas9、crispr/cas12a(cpf1)、crispr/cas12f为基础，已经开发出多种dna碱基编辑工具，可在基因组水平实现高效精准的点突变，且此过程中不会产生dna双链断裂。目前碱基编辑器主要有两种：胞嘧啶碱基编辑器(cbe，可介导c·g--t·a突变)和腺嘌呤碱基编辑器(abe，可介导a·t--g·c突变)。其中，cbe是将特定的胞嘧啶核苷脱氨酶(cytidine deaminase)与突变型核酸酶(如携带有d10a或突变的spcas9，称为nspcas9；或是功能失活型cas12a或cas12f，称为dcas12a或dcas12f)以及尿嘧啶糖基化酶抑制因子(ugi)融合，得到的融合蛋白可在sgrna的引导下，介导c·g--t·a突变。
2、现有cbe工具中的脱氨酶多属于胞嘧啶核苷脱氨酶(cytidine deaminase)家族，胞嘧啶核苷脱氨酶本身容易形成多聚体，存在安全风险[salter,j.d.,bennett,r.p.&smith,h.c.the apobec protein family:united by structure,divergent infunction.trends biochem sci 41,578-594(2016).]。胞
技术实现思路
1、为开发在基因表达、rna剪接、dna损伤及线粒体功能等多方面均具有高安全性的cbe工具，本专利技术提供了一种安全性高的碱基编辑器及其构建方法与应用。
2、本专利技术通过开发筛选新的胞苷脱氨酶突变体，将胞苷脱氨酶突变体与nspcas9融合，可获得新的融合蛋白，该新的融合蛋白作为碱基编辑器，用于dna水平特定位点特定碱基的突变。本专利技术开发出的碱基编辑器cbe可有效实现c-t单碱基替换，而且对基因表达、rna剪接、dna损伤及线粒体功能的影响有明显降低。本专利技术能有效提升单碱基编辑工具的安全性。
3、本专利技术的目的可以通过以下技术方案来实现：
4、本专利技术首先提供一种胞苷脱氨酶突变体，为将apobec1的突变体进行l173q突变所得的新的蛋白质，所述apobec1的突变体是指将apobec1的第90位氨基酸由色氨酸突变为酪氨酸，同时，将apobec1的第126位氨基酸由精氨酸突变为谷氨酸以后所得的突变体，记为ye1；
5、将apobec1的突变体进行l173q突变是指将ye1的第173位氨基酸由亮氨酸突变为谷氨酰胺；
6、其中，apobec1序列如seq.id no.1所示。
7、本专利技术提供的胞苷脱氨酶突变体为具有c-t单碱基编辑活性且低水平cas非依赖的dna脱靶效应的胞苷脱氨酶突变体。
8、本专利技术还提供一种安全性高的碱基编辑器，所述安全性高的碱基编辑器为将所述胞苷脱氨酶突变体融合于突变型核酸酶的不同位点，得到的新融合蛋白。
9、在本专利技术的一个实施方式中，所述突变型核酸酶选自nspcas9或其突变体，其中nspcas9的氨基酸序列如seq id no.2所示。
10、在本专利技术的一个实施方式中，所述安全性高的碱基编辑器为将所述胞苷脱氨酶突变体融合于nspcas9的n-末端构建的融合蛋白，所述nspcas9氨基酸序列如seq id no.2所示。
11、本专利技术还提供所述安全性高的碱基编辑器的构建方法，包括以下步骤：
12、将所述胞苷脱氨酶突变体融合于突变型核酸酶的不同位点，构建所述安全性高的碱基编辑器。
13、优选的，所述安全性高的碱基编辑器为将所述胞苷脱氨酶突变体融合于nspcas9的n-末端构建的碱基编辑器，所述nspcas9序列如seq id no.2所示。
14、本专利技术还提供所述安全性高的碱基编辑器的应用，所述安全性高的碱基编辑器为一种碱基编辑器cbe，用于实现c-t单碱基替换。
15、本专利技术还提供一种多核苷酸，编码所述胞苷脱氨酶突变体或编码所述安全性高的碱基编辑器。
16、本专利技术还提供一种载体，含有所述的多核苷酸。
17、本专利技术还提供一种宿主细胞，含所述安全性高的碱基编辑器，或含有所述载体。
18、本专利技术第还提供一种试剂盒，包含用于构建所述胞苷脱氨酶突变体或所述安全性高的碱基编辑器的试剂。
19、本专利技术涉及到产生基因点突变的融合蛋白及基因点突变的诱导方法。本专利技术开发了新的胞苷脱氨酶突变体，通过将胞苷脱氨酶突变体与spcas9为代表的突变型核酸酶融合，得到的新融合蛋白能对位于前间隔序列不同位置的胞嘧啶实现有效的c-t碱基突变。通过所述方法获得的融合蛋白在多方面均表现出高安全性和低风险。本专利技术的碱基编辑器具有低水平的rna脱靶效应，对细胞内基因表达及rna剪接的影响降低，具有低水平的dna损伤风险和线粒体损伤风险，可实现安全性更高的c-t单碱基替换，能有效拓宽单碱基编辑工具的应用，具有很高的本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种胞苷脱氨酶突变体，其特征在于，为将APOBEC1的突变体进行L173Q突变所得的新的蛋白质，所述APOBEC1的突变体是指将APOBEC1的第90位氨基酸由色氨酸突变为酪氨酸，同时，将APOBEC1的第126位氨基酸由精氨酸突变为谷氨酸以后所得的突变体，记为YE1；
2.根据权利要求1所述的一种胞苷脱氨酶突变体，其特征在于，所述胞苷脱氨酶突变体为具有C-T单碱基编辑活性且低水平Cas非依赖的DNA脱靶效应的胞苷脱氨酶突变体。
3.一种安全性高的碱基编辑器，其特征在于，所述安全性高的碱基编辑器为将权利要求1所述胞苷脱氨酶突变体融合于突变型核酸酶的不同位点，得到的新融合蛋白。
4.根据权利要求3所述一种安全性高的碱基编辑器，其特征在于，所述突变型核酸酶选自nSpCas9或其突变体，其中nSpCas9的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
5.根据权利要求4所述一种安全性高的碱基编辑器，其特征在于，所述安全性高的碱基编辑器为将所述胞苷脱氨酶突变体融合于nSpCas9的N-末端构建的融合蛋白。
6.权利要求3所述安全
7.一种多核苷酸，其特征在于，编码权利要求1所述胞苷脱氨酶突变体或编码权利要求3所述安全性高的碱基编辑器。
8.一种载体，其特征在于，含有权利要求7所述的多核苷酸。
9.一种宿主细胞，其特征在于，含权利要求3所述安全性高的碱基编辑器，或含有权利要求8所述载体。
10.一种试剂盒，其特征在于，包含用于构建权利要求1所述胞苷脱氨酶突变体或权利要求3所述安全性高的碱基编辑器的试剂。
...【技术特征摘要】
1.一种胞苷脱氨酶突变体，其特征在于，为将apobec1的突变体进行l173q突变所得的新的蛋白质，所述apobec1的突变体是指将apobec1的第90位氨基酸由色氨酸突变为酪氨酸，同时，将apobec1的第126位氨基酸由精氨酸突变为谷氨酸以后所得的突变体，记为ye1；
2.根据权利要求1所述的一种胞苷脱氨酶突变体，其特征在于，所述胞苷脱氨酶突变体为具有c-t单碱基编辑活性且低水平cas非依赖的dna脱靶效应的胞苷脱氨酶突变体。
3.一种安全性高的碱基编辑器，其特征在于，所述安全性高的碱基编辑器为将权利要求1所述胞苷脱氨酶突变体融合于突变型核酸酶的不同位点，得到的新融合蛋白。
4.根据权利要求3所述一种安全性高的碱基编辑器，其特征在于，所述突变型核酸酶选自nspcas9或其突变体，其中nspcas9的氨基酸序列如se...
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