【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因工程，尤其涉及一种β-果糖苷酶突变体及其制备方法与应用。
技术介绍
1、甜菊糖苷是从植物甜叶菊提取出来的一种高甜度的天然甜味剂。其中，甜菊苷为其主要成分，有明显的后苦味。为提高甜菊糖苷的口感与品质，现有技术主要是采用化学提纯的方法去除具有苦味的成分甜菊苷，此方法会造成大量的甜菊苷的浪费和工业废弃物，增大了生产成本，同时也不符合现在绿色环保的食品生产要求。因此，开发一种工艺简单、能耗低、产率高且绿色环保的酶法制备果糖型酶改质甜菊糖苷具有重要的意义。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供一种β-果糖苷酶突变体及其制备方法与应用，本专利技术的突变体能大幅度提高催化甜菊苷转化为果糖型酶改质甜菊糖苷的效率。
2、为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：
3、本专利技术提供了一种β-果糖苷酶突变体，所述β-果糖苷酶突变体为t82l+d88k、a143h、p162n、t183h+k185f、d213t、n231l、k279s和e302h中的任意一种。
4、作为优选，所述t82l+d88k的氨基酸序列如seq id no.3所示；所述a143h的氨基酸序列如seq id no.4所示；所述p162n的氨基酸序列如seq id no.5所示；所述t183h+k185f的氨基酸序列如seq id no.6所示；所述d213t的氨基酸序列如seq id no.7所示；所述n231l的氨基酸序列如seq id no.8所示；所述k2
5、所述t82l+d88k是由野生型的β-果糖苷酶氨基酸序列的第82位和第88位突变而来；所述野生型的β-果糖苷酶的第82位氨基酸为苏氨酸，所述t82l+d88k的第82位氨基酸为亮氨酸；所述野生型的β-果糖苷酶的第88位氨基酸为天冬氨酸；所述t82l+d88k的第88位氨基酸为赖氨酸；
6、所述a143h是由野生型的β-果糖苷酶氨基酸序列的第143位突变而来；所述野生型的β-果糖苷酶的第143位氨基酸为丙氨酸，所述a143h的第143位氨基酸为组氨酸；
7、所述p162n是由野生型的β-果糖苷酶氨基酸序列的第162位突变而来；所述野生型的β-果糖苷酶的第162位氨基酸为脯氨酸，所述p162n的第162位氨基酸为天冬酰胺；
8、所述t183h+k185f是由野生型的β-果糖苷酶氨基酸序列的第183位和第185位突变而来；所述野生型的β-果糖苷酶的第183位氨基酸为苏氨酸，所述t183h+k185f的第183位氨基酸为组氨酸；所述野生型的β-果糖苷酶的第185位氨基酸为赖氨酸；所述t183h+k185f的第185位氨基酸为苯丙氨酸；
9、所述d213t是由野生型的β-果糖苷酶氨基酸序列的第213位突变而来；所述野生型的β-果糖苷酶的第213位氨基酸为天冬氨酸，所述d213t的第213位氨基酸为苏氨酸；
10、所述n231l是由野生型的β-果糖苷酶氨基酸序列的第231位突变而来；所述野生型的β-果糖苷酶的第231位氨基酸为天冬酰胺，所述n231l的第231位氨基酸为亮氨酸；
11、所述k279s是由野生型的β-果糖苷酶氨基酸序列的第279位突变而来；所述野生型的β-果糖苷酶的第279位氨基酸为赖氨酸，所述k279s的第279位氨基酸为丝氨酸；
12、所述e302h是由野生型的β-果糖苷酶氨基酸序列的第302位突变而来；所述野生型的β-果糖苷酶的第302位氨基酸为谷氨酸，所述e302h的第302位氨基酸为组氨酸。
13、作为优选，所述野生型的β-果糖苷酶的氨基酸序列如seq id no.2所示。
14、作为优选，所述野生型的β-果糖苷酶来源于小麦拉氏杆菌。
15、本专利技术还提供了所述的β-果糖苷酶突变体在制备含有果糖型酶改质甜菊糖苷的产品中的应用。
16、本专利技术还提供了一种重组质粒，所述重组质粒包括编码所述的β-果糖苷酶突变体的核苷酸序列以及空载载体；
17、编码t82l+d88k的核苷酸序列如seq id no.11所示；
18、编码a143h的核苷酸序列如seq id no.12所示；
19、编码p162n的核苷酸序列如seq id no.13所示；
20、编码t183h+k185f的核苷酸序列如seq id no.14所示；
21、编码d213t的核苷酸序列如seq id no.15所示；
22、编码n231l的核苷酸序列如seq id no.16所示；
23、编码k279s的核苷酸序列如seq id no.17所示；
24、编码e302h的核苷酸序列如seq id no.18所示；
25、所述空载载体为ppic9k或pet28a。
26、本专利技术还提供了所述的重组质粒在制备含有果糖型酶改质甜菊糖苷的产品中的应用。
27、本专利技术还提供了一种重组菌，所述重组菌包括编码所述的β-果糖苷酶突变体的核苷酸序列以及空载菌；
28、编码t82l+d88k的核苷酸序列如seq id no.11所示；
29、编码a143h的核苷酸序列如seq id no.12所示；
30、编码p162n的核苷酸序列如seq id no.13所示；
31、编码t183h+k185f的核苷酸序列如seq id no.14所示；
32、编码d213t的核苷酸序列如seq id no.15所示；
33、编码n231l的核苷酸序列如seq id no.16所示；
34、编码k279s的核苷酸序列如seq id no.17所示；
35、编码e302h的核苷酸序列如seq id no.18所示；
36、所述空载菌为毕赤酵母x33或大肠杆菌。
37、本专利技术还提供了所述的重组菌在制备含有果糖型酶改质甜菊糖苷的产品中的应用。
38、本专利技术的有益效果：
39、本专利技术提供了β-果糖苷酶突变体，所述β-果糖苷酶突变体为t82l+d88k、a143h、p162n、t183h+k185f、d213t、n231l、k279s和e302h中的任意一种。本专利技术的突变体能大幅度提高催化甜菊苷转化为果糖型酶改质甜菊糖苷的效率，使转化率高达98.7％。
40、将突变体序列构建至ppic9k或pet28a载体上，最终转化至毕赤酵母x33或大肠杆菌。应用毕赤酵母或大肠杆菌工程菌种制备含有果糖型酶改质甜菊糖苷的产品中，可以提高提高催化甜菊苷转化为果糖型酶改质甜菊糖苷的效率。应用该毕赤酵母工程菌种分泌型表达该酶生产果糖型酶改质甜菊糖苷，工艺简单，产率高，能降低成本，适用于食品工业化应用。
本文档来自技高网...【技术保护点】
1.一种β-果糖苷酶突变体，其特征在于，所述β-果糖苷酶突变体为T82L+D88K、A143H、P162N、T183H+K185F、D213T、N231L、K279S和E302H中的任意一种。
2.根据权利要求1所述的β-果糖苷酶突变体，其特征在于，所述T82L+D88K的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述A143H的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述P162N的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示；所述T183H+K185F的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示；所述D213T的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示；所述N231L的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示；所述K279S的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示；所述E302H的氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示。
3.权利要求1～2任意一项所述的β-果糖苷酶突变体的制备方法，其特征在于，所述T82L+D88K是由野生型的β-果糖苷酶氨基酸序列的第82位和第88位突变而来；所述野生型的β-果糖苷酶的第82位氨基酸为苏氨酸，所述T82L+D88K的第82位氨基酸
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述野生型的β-果糖苷酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述野生型的β-果糖苷酶来源于小麦拉氏杆菌。
6.权利要求1～2任意一项所述的β-果糖苷酶突变体在制备含有果糖型酶改质甜菊糖苷的产品中的应用。
7.一种重组质粒，其特征在于，所述重组质粒包括编码权利要求1～2任意一项所述的β-果糖苷酶突变体的核苷酸序列以及空载载体；
8.权利要求7所述的重组质粒在制备含有果糖型酶改质甜菊糖苷的产品中的应用。
9.一种重组菌，其特征在于，所述重组菌包括编码权利要求1～2任意一项所述的β-果糖苷酶突变体的核苷酸序列以及空载菌；
10.权利要求9所述的重组菌在制备含有果糖型酶改质甜菊糖苷的产品中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种β-果糖苷酶突变体，其特征在于，所述β-果糖苷酶突变体为t82l+d88k、a143h、p162n、t183h+k185f、d213t、n231l、k279s和e302h中的任意一种。
2.根据权利要求1所述的β-果糖苷酶突变体，其特征在于，所述t82l+d88k的氨基酸序列如seq id no.3所示；所述a143h的氨基酸序列如seq id no.4所示；所述p162n的氨基酸序列如seq id no.5所示；所述t183h+k185f的氨基酸序列如seq id no.6所示；所述d213t的氨基酸序列如seq id no.7所示；所述n231l的氨基酸序列如seq id no.8所示；所述k279s的氨基酸序列如seq id no.9所示；所述e302h的氨基酸序列如seq id no.10所示。
3.权利要求1～2任意一项所述的β-果糖苷酶突变体的制备方法，其特征在于，所述t82l+d88k是由野生型的β-果糖苷酶氨基酸序列的第82位和第88位突变而来；所述野生型的β-果糖苷酶的第82位氨基...
【专利技术属性】
技术研发人员：盖爽爽，林伊灿，苏小龄，潘文权，蒋才云，江名，
申请(专利权)人：广西科技师范学院，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。