【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于一种人体蛋白的检测方法，特别涉及一种定量检测外周血中与血红蛋白(hb)结合的总tau(hb-t-tau)的检测方法，该hb-t-tau主要来自外周血红细胞。
技术介绍
0、技术背景
1、人的tau蛋白由染色体17q21上的16个外显子组成的微管相关蛋白tau(microtubule-associated protein tau，mapt)的基因编码。人类大脑中表达的tau蛋白有六种亚型，长度在352～441个氨基酸区间，分子量在45～65kda之间，包含0、1或2个氨基末端插入序列(0n、1n或2n)，3或4个微管结合重复序列(3r或4r)，以及一个短的羧基末端尾序列。tau蛋白在人类主要存在于神经元，在其它细胞只有少量的表达。在神经元中，tau与微管或微管蛋白结合，使轴突远端的微管保持一种动态稳定状态，这对维持轴突生长锥的动力学和有效的轴突转运非常重要。此外，tau也可以与肌动蛋白结合，并影响肌动蛋白和肌动蛋白丝与微管的相互作用。tau是一种磷蛋白，其生物活性受其磷酸化程度的调节。
2、tau蛋白参与多种神经退行性疾病的发病过程，这些疾病包括阿尔茨海默病(alzheimer’s disease，ad)、皮克病(pick’s disease)、进行性核上麻痹(progressivesupranuclear palsy，psp)、皮层基底节变性(corticobasal degeneration，cbd)、嗜银颗粒痴呆(argyrophilic grain disease，agd)以及额颞叶痴
3、目前国际上开发了多种用于检测ad患者血浆中p-tau和t-tau的方法，相对p-tau181/217，目前多数方法检测血浆中的t-tau未能显示其在ad患者有显著增高，这与ad患者脑脊液t-tau含量显著增高不一致。迄今为止，只有imr(免疫磁衰减测试法)t-tau检测方法可以检测到ad患者血浆中t-tau含量的增高，其原因并非仅仅是检测敏感性的问题，而超高敏感性的simoa(单个免疫分子测试法)技术在检测血浆t-tau含量变化时，其区分ad和对照的效率较低，提示血浆中的某些因素影响了t-tau检测的准确性。seol nationaluniversity(wo2020031116a1)通过用蛋白酶和磷酸酶抑制剂处理血浆样本后在利用simoa技术检测血浆中的t-tau，发现血浆t-tau含量的变化在ad高于对照，但区分ad和对照的准确度只有80.2％，但这一数值仍显著低于脑脊液t-tau变化区分ad和对照的准确度。
4、现有基于血浆或血清t-tau的检测方法未能检测出血浆t-tau含量在ad发生显著变化的原因可能有以下几个原因：1)浓度较低，目前各种检测方法测定的数据显示，血浆t-tau在1～100pg/ml之间；2)血浆中异噬性抗体、脂蛋白等干扰因素的存在；3)来自红细胞中tau蛋白的潜在干扰。根据目前的报道，红细胞中tau的含量约在1μg/ml，远高于血浆，少量溶血即可污染血浆tau的测试。鉴于红细胞中含有较高浓度的tau，而且可以反映脑中tau含量的变化，直接检测红细胞中的tau含量变化用于判定ad及其它tau蛋白病的神经退变将是一个合理的选项。以往研究表明，红细胞中的tau往往与其它蛋白如aβ或α-突触核蛋白(α-syn)形成复合物。但红细胞中的tau是否与血红蛋白结合，这种结合形式的tau在ad发生何种变化尚未有报道。
技术实现思路
1、本专利技术公开了一种与血红蛋白(hemglobin，hb)结合的总tau蛋白(hb-t-tau)的定量检测方法，所述hb-t-tau复合物主要来自外周血红细胞。所述方法包括，将链球菌蛋白g(protein g)或链霉亲和素(streptavidin，sa)固定在固相载体上，随后加入抗hb抗体(ahb)或生物素化抗hb抗体(b-ahb)形成结合体，并分别与样本中的hb-t-tau复合物、酶标记抗t-tau抗体(e-atau)或生物素标记抗t-tau抗体(b-atau)和酶标记亲和素(e-sa)、化学发光液进行反应等步骤。其中，在酶标记抗体或酶标记亲和素的反应液中加入聚乙二醇(peg)以增强酶标抗体与抗原以及酶促化学发光反应的效率。
2、其中，所述固相载体选自：酶标板、微孔板、试管、磁珠或微孔滤膜，此处优选的所述固相载体为酶标板；所述固相载体的材质选自：聚苯乙烯、聚氯乙烯、硝酸纤维素、尼龙等。
3、本专利技术所述的检测方法，进一步包括，血液样本的收集，atau与样本中的hb-t-tau在液相反应液中形成hb-t-tau-atau复合物(其中的atau是酶标记的抗t-tau的抗体，包括任何可以和t-tau特异性结合的抗体；其中的液相反应液中含有一定量的peg，复合物和上述结合体(即protein g或sa与ahb或b-ahb形成的结合体)结合，采用发光法对抗原抗体结合物进行检测等步骤。
4、本专利技术所述的检测方法，通过预先在固相形成proten g或sa与ahb或b-ahb的结合体、预先在液相形成hb-t-tau-atau复合物，以及在酶标记抗体或酶标记亲和素反应液中加入聚乙二醇(peg)，增强了抗原-抗体的结合效率和酶促化学发本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种红细胞中与血红蛋白(Hb)结合的T-Tau(Hb-T-Tau)的检测方法，其特征在于，所述方法包括，将Protein G或链霉亲和素(SA)固定在固相载体上，随后加入抗Hb抗体(B-AHb)或生物素化抗Hb抗体(B-AHb)形成结合体，并分别与样本中的Hb-T-Tau复合物、酶标抗T-Tau抗体(E-ATau)、化学发光反应液进行反应的步骤，或分别与生物素标记抗T-Tau抗体(B-ATau)、酶标记SA(E-SA)、化学发光液进行反应的步骤；其中，在酶标记ATau或酶标记SA的反应步骤中，加入聚乙二醇(PEG)；其中所述PEG的浓度为0.1～12％，优选的为2～8％，更为优选的为5％；其中，所述固相载体选自酶标板、微孔板、试管、磁珠或微孔滤膜，所述固相载体的材质选自：聚苯乙烯、聚氯乙烯、硝酸纤维素、尼龙。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，进一步包括，血液样本的收集，在含有PEG的液相反应液中形成Hb-T-Tau-ATau复合物，其中ATau为酶标记的抗Tau抗体；复合物和上述结合体结合，采用发光法对抗原抗体结合物进行检测的步骤。
3.根据
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法，步骤如下：
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法，步骤如下：
6.一种检测试剂盒，所述试剂盒包括特异性抗Hb抗体(AHb)，固相载体，Protein G或SA，抗Tau抗体(ATau)，发光剂，生物素或酶，必要的溶剂，使用说明书，PEG；其中，所述PEG可以是任何分子量的PEG，包括PEG-200～PEG-20000，优选的为PEG-4000～PEG-8000，更优选的为PEG-6000。
7.根据权利要求6的试剂盒，所述试剂盒还可以包括Hb-Tau标准蛋白，生物素标记的ATau(B-ATau)，酶标记的ATau(E-ATau)。还可以包括酶标记亲和素(E-SA)，其可特异性的与B-ATau相结合。
8.根据权利要求6的试剂盒，所述试剂盒其中所述抗Tau抗体为酶标记的抗T-Tau抗体，所述酶可以为碱性磷酸酶(Alkaline Phosphatase，AP)、辣根过氧化物酶(HorseradishPeroxidase，HRP)或葡萄糖氧化酶(Glucose Oxidase，GO)；其中，所述抗Tau抗体可以为生物素化的抗Tau抗体。
9.根据权利要求6的试剂盒，所述检测试剂盒其中还可以包括荧光素、胶体金等其他物质及其标记的标记抗Tau抗体和亲和素；还包括缓冲液、封闭液。
10.权利要求6所述试剂盒的应用方法，其特征在于，以Protein G或SA包被固相载体如96孔酶标板，使其与作为捕获抗体的AHb或B-AHb结合，用于捕获样本中的Hb-T-Tau复合物；再以抗Tau抗体为检测抗体，检测与捕获的与Hb相结合的Tau，本专利技术进一步包括，所述试剂盒中的试剂在制备检测阿尔茨海默病试剂盒中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种红细胞中与血红蛋白(hb)结合的t-tau(hb-t-tau)的检测方法，其特征在于，所述方法包括，将protein g或链霉亲和素(sa)固定在固相载体上，随后加入抗hb抗体(b-ahb)或生物素化抗hb抗体(b-ahb)形成结合体，并分别与样本中的hb-t-tau复合物、酶标抗t-tau抗体(e-atau)、化学发光反应液进行反应的步骤，或分别与生物素标记抗t-tau抗体(b-atau)、酶标记sa(e-sa)、化学发光液进行反应的步骤；其中，在酶标记atau或酶标记sa的反应步骤中，加入聚乙二醇(peg)；其中所述peg的浓度为0.1～12％，优选的为2～8％，更为优选的为5％；其中，所述固相载体选自酶标板、微孔板、试管、磁珠或微孔滤膜，所述固相载体的材质选自：聚苯乙烯、聚氯乙烯、硝酸纤维素、尼龙。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，进一步包括，血液样本的收集，在含有peg的液相反应液中形成hb-t-tau-atau复合物，其中atau为酶标记的抗tau抗体；复合物和上述结合体结合，采用发光法对抗原抗体结合物进行检测的步骤。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法，步骤如下：
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法，步骤如下：
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法，步骤如下：
6.一种检测试剂盒，所述试剂盒包括特异性抗hb抗体(ahb)，固相载体，protein g或...
【专利技术属性】
技术研发人员：于顺，李鹏杰，李昕，蔡燕宁，
申请(专利权)人：首都医科大学宣武医院，
类型：发明
国别省市：
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