【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程领域，具体涉及l-肌肽制备方法即转运蛋白yjem的新用途。
技术介绍
1、l-肌肽是100多年前在乌克兰的charkow大学由gulewitsch和在分析肉类提取物时发现的[1]。它是一种天然存在的二肽，由β-丙氨酸和l-组氨酸组成，广泛分布在哺乳动物组织中，在心脏、骨骼肌以及大脑水平上发挥其生物活性并在其中高度聚集。一些无脊椎动物物种也含有肌肽。自该活性肽发现的一百多年来，已有大量的研究发现或者证明l-肌肽具有显著的抗氧化、消除胞内自由基、抗衰老等活性，并且在临床上用于高血压、心脏病、老年性白内障、溃疡、抗肿瘤、促进伤口愈合等方面的辅助治疗，由于其抗氧化的活性强，毒副作用低并具有多种生理活性,该活性肽及其衍生物在医药、保健、卫生、化妆品等领域已有广泛的应用，市场空间广阔。
2、l-肌肽的化学合成已被广泛报道，成为目前生产l-肌肽的商业方式。化学合成方法虽然比较多，但主要有以下两种[2]：一是利用β-丙氨酸参与合成。其主要路线是β-丙氨酸经氨基保护、羧基活化后与保护的l-组氨酸缩合，然后脱掉保护基团得到l-肌肽。该路线比较复杂，收率低，肽键形成过程中易消旋，影响产品纯度，并且溶剂消耗大，易造成环境污染；二是摒弃β-丙氨酸参与的反应。主要原理为l-组氨酸先与不同的β-丙氨酸前体生成肽键，再进一步转换为l-肌肽。该路线相对简单，省去对不同基团的保护和脱保护的过程，避免消旋反应的发生，但是需要无水操作，要求比较严格。以上的路线随着工艺的差异，产品得率大约在60％-80％左右。
3、为了避免
4、yjem是大肠杆菌中的一种转运蛋白，属于氨基酸-多胺-有机阳离子(apc)转运蛋白超家族，是gaba反向转运蛋白(gga)家族中的一个未特化成员。目前并没有关于yjem可以转运l-肌肽的相关现有技术的公开。
5、[1]guiotto a,calderan a,ruzza p,et al.carnosine and carnosine-relatedantioxidants:a review[j].curr med chem.2005；12(20):2293-315.
6、[2]吴长增,宋晓平.l-肌肽的合成与应用[j].许昌学院学报,2009(5):4.
技术实现思路
1、针对上述不足，本专利技术提供了一种l-肌肽制备方法，即转运蛋白yjem的新用途，经验证，yjem能够显著提高过表达重组菌株发酵生产l-肌肽的产量，本专利技术是yjem转运l-肌肽技术的首次公开。
2、本专利技术中yjem转运蛋白简称为yjem，其编码基因为yjem。
3、本专利技术的技术方案包括：
4、一方面，本专利技术提供了一种yjem转运蛋白或其编码基因在转运l-肌肽中的应用，所述的yjem的氨基酸序列如seq id no：1所示。
5、具体地，所述的转运蛋白用于促进l-肌肽向胞外转运。
6、具体地，所述的编码基因通过在表达l-肌肽的菌株中过表达发挥作用。
7、进一步具体地，所述的编码基因的核苷酸序列如seq id no：2所示。
8、进一步具体地，所述的过表达为构建过表达质粒。
9、优选地，所述的过表达质粒为pez07-yjem。
10、进一步具体地，所述的表达l-肌肽的菌株为基因工程菌株。
11、优选地，所述的基因工程菌株为大肠杆菌菌株。
12、进一步优选地，所述菌株的保藏编号为cgmcc no.27382。
13、另一方面，本专利技术提供了yjem转运蛋白或其编码基因在生产l-肌肽中的应用，所述yjem的氨基酸序列如seq id no：1所示。
14、具体地，所述应用为提高l-肌肽产量。
15、又一方面，本专利技术提供了一种yjem编码基因，所述yjem编码基因的核苷酸序列如seq id no：2所示。
16、又一方面，本专利技术提供了一种表达质粒的构建方法，包括以下步骤：
17、s1扩增yjem基因片段，获得目的基因；
18、s2将目的基因与酶切回收的载体片段进行克隆构建；
19、s3转化细胞，筛选阳性克隆，提取质粒验证，得到含有yjem转运蛋白的表达质粒。
20、优选地，步骤s1以大肠杆菌w3110基因组为模板，利用引物对扩增yjem基因片段。
21、优选地，步骤s1中所述的引物对为ptr166-f/ptr166-r；所述的引物ptr166-f的核苷酸序列如seq id no：3所示；所述的引物ptr166-r的核苷酸序列如seq id no：4所示。
22、进一步优选地，所述步骤s1中所述的yjem基因核苷酸序列如seq id no：2所示，所述yjem的氨基酸序列如seq id no：1所示。
23、优选地，步骤s2中所述的载体为pez07载体。
24、进一步优选地，步骤s2中所述的目的基因yjem与pez07载体片段的纳摩尔比为1：2。
25、优选地，步骤s2中所述的酶为ncoi限制性内切酶和/或xhoi限制性内切酶。
26、优选地，步骤s3中所述转化细胞为加入感受态细胞，进行热击转化。
27、进一步优选地，步骤s3所述的感受态细胞选自tg1感受态细胞、dh5α感受态细胞、jm109感受态细胞中的一种或多种。
28、进一步优选地，步骤s3所述的感受态细胞为tg1感受态细胞。
29、优选地，步骤s3中所述的加入感受态细胞后，包括将其混匀放置42℃热击2min，冰浴2min的步骤。
30、优选地，步骤s3所述的壮观霉素浓度为80 150mg/l。
31、进一步优选地，步骤s3所述的壮观霉素浓度为100mg/ml。
32、又一方面，本专利技术提供了一种l-肌肽的生产方法，所述生产方法包括构建过表达yjem编码基因的基因工程菌株。
33、具体地，所述的yjem编码基因为seq id no：2，所述的基因工程菌株为保藏编号为cgmcc no.27382的大肠杆菌菌株。
34、由此，本专利技术同时提供了保藏编号为cgmcc no.27382的大肠杆菌菌株及其在生产l-肌肽中的应用，具体为提高l-肌肽产量中的应用。
35、所述菌株于2023年5月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为中国北京，保藏编号为cgmcc no.273本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种YjeM转运蛋白或其编码基因在转运L-肌肽中的应用，其特征在于，所述YjeM的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的转运蛋白用于促进L-肌肽向胞外转运；所述的编码基因通过在表达L-肌肽的菌株中过表达发挥作用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的编码基因的核苷酸序列如SEQ IDNO：2所示。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的过表达为构建过表达质粒；所述的过表达质粒为pEZ07-yjeM。
5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的表达L-肌肽的菌株为基因工程菌株；所述的基因工程菌株为大肠杆菌菌株，保藏编号为CGMCCNo.27382。
6.一种YjeM转运蛋白或其编码基因在生产L-肌肽中的应用，其特征在于，所述YjeM的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
7.一种yjeM编码基因，其特征在于，所述yjeM编码基因核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。
8.一种L-肌肽的生产方法，其特征在于，所述
9.一种基因工程菌株，其特征在于，所述基因工程菌株于2023年5月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为中国北京，保藏编号为CGMCCNo.27382，分类命名为大肠埃希氏菌。
10.权利要求9所述的基因工程菌株的应用，其特征在于，所述应用为在生产L-肌肽中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种yjem转运蛋白或其编码基因在转运l-肌肽中的应用，其特征在于，所述yjem的氨基酸序列如seq id no：1所示。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的转运蛋白用于促进l-肌肽向胞外转运；所述的编码基因通过在表达l-肌肽的菌株中过表达发挥作用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的编码基因的核苷酸序列如seq idno：2所示。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的过表达为构建过表达质粒；所述的过表达质粒为pez07-yjem。
5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的表达l-肌肽的菌株为基因工程菌株；所述的基因工程菌株为大肠杆菌菌株，保藏编号为cgmccno.27382。
6.一种yjem转运蛋白或其编码基因在生产l-肌肽中...
【专利技术属性】
技术研发人员：朱文娟，江君君，万丽花，田锋，薛金丹，
申请(专利权)人：苏州华赛生物工程技术有限公司，
类型：发明
国别省市：
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