一株具有毒力和侵袭力的阪崎肠杆菌新菌株制造技术

一株具有毒力和侵袭力的阪崎肠杆菌新菌株，阪崎肠杆菌菌株现已在中国微生物菌种保藏中心已专利保藏。保藏日期为２０１０年０４月０６日，保藏编号：ＣＧＭＣＣ?Ｎｏ．３７２４。本发明专利技术点是：半乳糖醇（卫矛醇）阳性、苦可仁甙阴性、明胶酶阳性、乳糖为迟缓发酵等４种生物特性的阪崎肠杆菌种。该菌株经小鼠急性毒性试验表明，具有较强的毒力和侵袭力，菌株经中国药品生物制品检定所依据《伯杰细菌鉴定手册》第９版对其进行鉴定，确认阪崎肠杆菌。０８１９－０４１生物型菌株经中国医学科学院医学信息研究所查新“未检索到半乳糖醇（卫矛醇）阳性；②苦可仁甙阴性；③明胶酶阳性；④乳糖为迟缓发酵等４种生物特性的阪崎肠杆菌种。”为国际上首次发现该生物型阪崎肠杆菌。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一株阪崎肠杆菌新菌株，尤其涉及一株具有毒力和侵袭力的阪崎肠杆 菌新菌株。
技术介绍
奶粉为生活中常用的食品，特别是婴幼儿对乳粉的需求量大，乳粉质量不佳直接 影响到婴幼儿身体健康，2003年1月9日，美国美赞臣公司向美国食品及药品管理局(FDA) 报告要求回收在美国生产的一批罐装早产儿特殊配方乳粉，回收原因是在该批产品中检验 出极微量的阪崎肠杆菌(Enterobactersakazakii)。此后，“问题乳粉”事件迅速引起世界 广泛关注，污染源阪崎肠杆菌也成为焦点目标。阪崎肠杆菌(Enterobacter sakazakii)为 肠杆菌科、肠杆菌属，有周鞭毛、能运动的无芽孢G-短小杆菌。阪崎肠杆菌最初以婴儿配方 乳粉作为传播媒介，导致新生儿出现脑膜炎、败血病、小肠结肠炎坏死等症状。致死率可高 达80%。美国食品药品管理局(FDA)于2002年提出在婴幼儿配方乳粉中检测阪崎肠杆菌， 随着对阪崎肠杆菌检测的重视，国家质量监督检验检疫总局要求企业生产的每批次婴幼儿 配方乳粉出厂前都要进行自检，做到对阪崎肠杆菌检测工作日常化。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一株具有毒力和侵袭力的阪崎肠杆菌新菌株。在阪崎肠杆 菌分类上具有较大的价值。本专利技术是这样来实现的，其特征是命名为阪崎肠杆菌(Enterobacter sakazakii)，现保存在中国微生物菌株保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳 区北辰西路1号院3号，保藏日期为2010年04月06日，保藏编号CGMCCNo. 3724。提取方法为(1)用预热45°C缓冲蛋白胨水500ml与IOOg乳粉摇勻，36°C 士 1°C培养18_24h ；(2)移取上述培养液IOml加于90ml肠道菌增菌肉汤中36°C 士 1°C培养18_22h ；(3)取肠道菌增菌肉汤培养物一环划线接种伊红美蓝、山梨醇麦康凯、麦康凯琼脂 平板各1块，36°C 士 1°C培养18-24h ；(4)观察菌落形态，从山梨醇麦康凯平板上挑取不发酵山梨醇的单个菌落接种4 支 TSA 钭面、36 °C 士 1°C 培养 18-24h ；(5)用钭面做触酶、氧化酶、G染色、进一步生化鉴定。本专利技术的优点是1、卫矛醇阳性，2、苦可仁甙阴性，3、明胶酶阳性，4、乳糖为迟缓 发酵(72h)。具体实施例方式本专利技术是这样实现的1、材料与方法材料菌种来源阪崎肠杆菌标准株ATCC29544、ATCC29004、CMCC45401由中国药品生物 制品检定所提供。0819-041、0814-179、090830、091006、100309、100412 菌株由本中心分离， 0819-041是本专利技术中阪崎肠杆菌新菌株的代号，现保存在中国微生物菌株保藏管理委员会 普通微生物中心，专利保藏日期为2010年04月06日，保藏编号CGMCC No. 3724。培养基缓冲蛋白胨水(BP)、肠道菌增菌肉汤(EE)、改良月桂基硫酸盐胰蛋 白胨肉汤-万古霉素(mLST-Vm)、伊红美蓝(EMB)、麦康凯(MacConKey)、山梨醇麦康凯 (SorbitolMacConKey)，营养琼脂(NutirentAgar)为杭州天和微生物试剂有限公司生产。 结晶紫中性红胆盐葡萄糖琼脂(VRBGA)，显色培养基(Xa-GicA)由北京陆桥公司生产。微量生化管杭州天和微生物试剂有限公司生产，部分为自配。所用培养基经实验 室生物学质控考核，符合微生物生长需要。统计学处理实验数据统计处理采用SPSS11. 5软件进行。2.方法2. 1检测方法基础研究2. 1. 1.两种修复培养基(BP、蒸馏水)比较研究(1)取2_8°C冰箱保存3个月(休眠期)阪崎肠杆菌斜面直接制备菌悬液，从 KT1-IO-9作连续10倍稀释，同时取ICT9-IO-1O. Iml涂布平板各2块，36°C 士 1°C培养18_24h， 菌落计数。(2)取上述菌悬液从KT9-IiT1分别取0. Iml加入A组9ml含10%婴儿配方乳粉 蒸馏水管中；B组9ml含10%婴儿配方乳粉BP培养液中、置36°C 士 1°C 18_24h培养。(3)取上述A、B培养液9ml移入90mlEE增菌肉汤中，于36°C 士 1°C培养18_24h， 划线接种 EMB、MacConKey、SorbitoIMacConKey、VRBGA, Xa-GicA 琼脂平板、36°C 士 1°C培养 18-24h观察结果并记录(试验重复3次)。2. 1. 1.两种肠道增菌培养基(mLST-Vm、EE)的比较研究(1)取18_24h培养的阪崎肠杆菌新鲜斜面制备菌悬液。用无菌生理盐水从10-1-10-9作连续10倍稀释，同时取10-9-10-10. Iml涂布平 板各2块，360C 士 1°C培养18-24h，菌落计数。(2)取上述菌悬液从IiT9-IO-1分别取0. Iml加入9ml mLST-Vm肉汤与9mlEE肉汤 管中、置36°C 士 1°C培养18-24h，观察结果并记录(试验重复3次)。2. 1. 3阪崎肠杆菌在5种分离培养基上生物学特征及生长情况比较(1)取18_24h培养的阪崎肠杆菌新鲜斜面制备菌悬液。(2)用无菌生理盐水从KT1-IO-9作连续10倍稀释，取10-4、10_5、10-6分别取0. Iml 涂布 NutirentAgar, EMB, MacConKey、SorbitoIMacConKey、VRBGA, Xa-GicA 琼脂平板， 于36 °C 士 1°C培养18-24h进行比较(试验重复3次)。2. 2检测方法应用2. 2. 1样品检测分离鉴定共分4个步骤(1)样品修复培养(前增菌)无菌称取IOOg乳粉加入500ml预热45°C BP中，混 勻，经 36°C 士 1°C培养 18-24h。(2)样品肠道增菌培养移取IOml加入90mlEE肉汤中，于36°C 士 1°C培养18_24h。菌株号ATCC29544++ — —-+ --+-+++++十++ -++ATCC29004++ ---+ --+-++++++++ 一++CMCC45401++ ---+ ---+-++++++++ 一++(3)样品分呙培养取EE增菌肉汤培养物1环，分别划线接种EMB、MacConKey, SorbitolMacConKey 琼脂平板各 1 块，置 36°C 士 1°C培养 18_24h。(4)菌株生化鉴定挑取单个可疑菌落接种TSA钭面，生化鉴定。2. 2. 3 0819-041菌株急性毒性试验用灭菌营养肉汤制备菌悬液，培养6h，菌液浓度为104_105/ml。接种昆明小鼠体重 17g-19g。每组3只，实验组腹腔注射菌悬液0. 5ml，同时设对照组注射灭菌营养肉汤0. 5ml。 观察小白鼠中毒症状，如有死亡进行解剖观察(江西省职业病防治研究院为CNAS认可实验室)。2. 2. 4 0819-041菌株感染动物组织病理学切片检测取死亡小鼠组织以10%甲醛固定后，再经石蜡包埋，切片后用苏木素-伊红染色， 镜检病理变化(江西省职业病防治研究院为CNAS认可实验室)。2. 2. 5三种方法检测阪崎肠杆菌的应用比较应用本研究方法与SN/T1632. 1-2005行业标准、GB/T4789. 40-本文档来自技高网...

【技术保护点】
一株具有毒力和侵袭力的阪崎肠杆菌新菌株，其特征是命名为阪崎肠杆菌（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ　ｓａｋａｚａｋｉｉ），现保存在中国微生物菌株保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路１号院３号，保藏日期为２０１０年０４月０６日，保藏编号：ＣＧＭＣＣ　Ｎｏ．３７２４。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：高建新，陈海婴，卢兆芸，
申请(专利权)人：南昌市疾病预防控制中心，
类型：发明
国别省市：36[中国|江西]