【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物医学领域，特别是涉及一种生物标志物检测方法。
技术介绍
1、生物标志物是必不可少的实体，自人类生物学的认识以来就一直存在着。生物标志物被指定为"可以客观地测量和评估的物质或活动，作为正常生物过程、致病过程或对治疗干预的药理反应的指标"。理想的生物标志物应该是可量化的、可靠的、在疾病状况下有相当高/低的表达、与结果进展相关、在不同性别和种族群体中可保持一致，并且具有成本效益。生物标志物包括蛋白质、信使核糖核酸(mrna)、外泌体、代谢物、循环dna和肿瘤细胞，可以从组织、血液和尿液中收集获得。对疾病相关的生物标志物进行微量检测和定量的能力，可以在早期阶段对相应的疾病进行诊断。因此，开发高选择性和高灵敏度的生物标志物的方法，成为疾病筛查、诊断、预后和治疗康复的准确方法并有很好的发展前景。近年来，生物标志物的检测已经取得了实质性的重大进展。基于crispr-cas12a的传感技术由于其高精确度和出色的功能化效率，在诊断应用方面有很大的潜力。原则上，非核酸目标必须通过生物传导元件转化为可识别的核酸信号，这些信号可以被crispr-cas吸收。
2、但是，目前，临床一些生物标志物检测方法用时较长、操作复杂、假阳性高，且其灵敏度对于大多人血清标志物不一定适用。
技术实现思路
1、(一)要解决的技术问题
2、为了解决现有技术的上述问题，本专利技术提供一种生物标志物的检测方法，以人体crp为代表，以免疫dna传感器技术为基础，利用特异性识别crp的免疫磁珠
3、(二)技术方案
4、为了达到上述目的，本专利技术采用的主要技术方案包括：
5、一种生物标志物的检测方法，包括如下步骤：
6、s1,设计得到适配体-引物探针；所述适配体-引物探针中包含rca反应引物序列；
7、s2,设计得到ts和nts，并利用所述ts和所述nts，设计得到p2-ts、p1-nts-a和nts-b；所述p2-ts、所述p1-nts-a和所述nts-b的核苷酸序列分别为：
8、p2-ts：
9、5’-cattatgtgctgccatatctacttcagaaaagccaccatc-3’；
10、p1-nts-a：5’-tagactgcctttt-3’；
11、nts-b：5’-ctgaagtagatatggcagcacataatg-3’；
12、s3,设计得到crrna，并利用cas12a酶识别所述crrna，得到cas12a-crrna复合物；
13、s4,设计得到环状dna；所述环状dna的核苷酸序列为：tgtcttcgccttcttgtttcctttccttgaaacttcttcctttctttcttt cgactaagcacc；
14、s5，设计得到荧光报告基因ssdna-fq探针，所述荧光报告基因ssdna-fq探针的核苷酸序列为：5’-tttattt-3’；
15、s6，利用抗体与磁珠进行偶联，制备得到免疫磁珠；
16、s7，利用所述免疫磁珠和所述适配体-引物探针，识别并捕获靶标物，得到三明治夹心复合物；
17、s8，构建rca-crispr反应体系，启动rca反应，获得具有若干个重复单链dna的长链ssdna；所述长链ssdna的核苷酸序列为：
18、3’-taacttaatgtggagtcggggatggtaataattatctgacggagtcg gtggtagtggaaacgataaattggagtcgcgaaggtcgaa-5’；
19、s9，通过所述长链ssdna与所述p2-ts、所述p1-nts-a和所述nts-b互补配对，得到邻近复合物，并通过所述cas12a-crrna复合物识别所述邻近复合物，使crispr-cas12a系统激活，得到基于crispr cas12a的dna免疫传感器；所述邻近复合物带有pam序列；
20、s10，利用所述dna免疫传感器，对人血清中的生物标志物进行检测，得到所述生物标志物的检测结果。
21、进一步地，所述s1，具体步骤包括：
22、s11，设计得到与所述靶标物高特异性结合的适配体序列；
23、s12，设计得到所述rca反应中的引物序列；
24、s13，通过将所述引物序列插在所述特异适配体序列之后，获得所述适配体-引物探针。
25、进一步地，所述s2，具体步骤包括：
26、s21，根据所述长链ssdna和所述crrna，设计得到所述p2-ts；所述p2-ts序列包含分别与所述长链ssdna和所述crrna互补的两段序列；
27、s22，根据所述长链ssdna和所述ts，利用所述nts设计得到p1-nts-a和nts-b；所述p1-nts-a包含分别与所述长链ssdna和所述ts互补的两段序列；所述nts-b包含与所述ts互补的一段序列；所述p1-nts-a和所述nts-b均带有不完整的pam序列。
28、进一步地，所述s6，具体步骤包括：
29、s61，将所述磁珠进行活化，得到活化磁珠；
30、s62，将所述活化磁珠与抗体进行偶联，得到免疫磁珠。所述抗体的浓度为0.1～2μg/ml。
31、进一步地，所述s7，具体步骤包括:
32、s71，将所述免疫磁珠和所述适配体-引物探针，用磷酸盐缓冲液进行稀释，获得免疫磁珠稀释液和适配体-引物探针稀释液；
33、s72，将人血清用所述磷酸盐缓冲液稀释80～120倍，获得人血清稀释液；
34、s73，分别将所述免疫磁珠稀释液、所述适配体-引物探针稀释液和所述人血清稀释液加入低吸附管内，混匀后孵育，并进行磁珠清洗，获得所述三明治夹心复合物。
35、进一步地，所述免疫磁珠浓度稀释液为0.1μg/ml～5μg/ml，所述适配体-引物探针稀释液浓度为5nm～100nm，所述孵育时间为10～90min。
36、进一步地，所述s8，具体步骤包括：
37、s81,将所述三明治夹心复合物、所述cas12a-crrna复合物和所述荧光报告器ssdna-fq在离心管中进行混合，然后向离心管中加入所述环状dna、脱氧核苷三磷酸、10×phi29 dna聚合酶缓冲溶液、所述p2-ts、所述p1-nts-a、所述nts-b和超纯水，最后迅速加入phi29 dna聚合酶，并快速混匀，得到所述rca-crispr反应体系；
38、s82，将所述rca-crispr反应体系低速离心后，放入孵育仪中，在37℃下孵育，进行rca反应，本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种生物标志物检测方法，其特征在于，包括：
2.根据权利要求1所述的生物标志物检测方法，其特征在于，所述S1，包括：
3.根据权利要求1所述的生物标志物检测方法，其特征在于，所述S2，包括：
4.根据权利要求1所述的生物标志物检测方法，其特征在于，所述S6，包括：
5.根据权利要求1所述的生物标志物检测方法，其特征在于，所述S7，包括:
6.根据权利要求5所述的生物标志物检测方法，其特征在于，所述免疫磁珠稀释液浓度为0.1μg/mL～5μg/mL，所述适配体-引物探针稀释液浓度为5nM～100nM，所述孵育时间为10～90min。
7.根据权利要求1所述的生物标志物检测方法，其特征在于，所述S8，包括：
8.根据权利要求7所述的生物标志物检测方法，其特征在于，所述Phi29DNA聚合酶的浓度为1U/mL～10000U/mL。
9.根据权利要求1所述的生物标志物检测方法，其特征在于，所述S9，包括：
10.根据权利要求1所述的生物标志物检测方法，其特征在于，所述S10，包
...【技术特征摘要】
1.一种生物标志物检测方法，其特征在于，包括：
2.根据权利要求1所述的生物标志物检测方法，其特征在于，所述s1，包括：
3.根据权利要求1所述的生物标志物检测方法，其特征在于，所述s2，包括：
4.根据权利要求1所述的生物标志物检测方法，其特征在于，所述s6，包括：
5.根据权利要求1所述的生物标志物检测方法，其特征在于，所述s7，包括:
6.根据权利要求5所述的生物标志物检测方法，其特征在于，所述免疫磁珠稀释液浓度为0.1μg/ml...
【专利技术属性】
技术研发人员：孙铁强，王天辉，王文，郭长江，姚站馨，王锋，虞立霞，
申请(专利权)人：军事科学院军事医学研究院环境医学与作业医学研究所，
类型：发明
国别省市：
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