【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于动物病原检测，具体涉及一种基于免疫磁珠和数字pcr检测asfv的试剂盒与方法。
技术介绍
1、非洲猪瘟(asf)是一种由非洲猪瘟病毒(asfv)引起的急性疾病，常常导致家猪和野猪死亡，并对受影响国家的养猪业造成巨大的打击。由于其巨大的危害，asf被世界动物卫生组织(woah)列为通报疾病和重要的跨境动物疾病。asfv具有复杂的结构和基因组成，可以在环境中保持稳定。病猪以血液、粪便，唾液和气溶胶等形式将病毒从体内排出，健康猪可以通过接触环境中的asfv感染asf,导致asfv在猪群中迅速的扩散。由于目前尚无商业疫苗或有效治疗的方法，及时的检测和淘汰病猪是养殖场防控asf的主要手段，因此asfv的检测方法对于防控asf显得极其重要。
2、目前，qpcr被世界动物卫生组织(oie)认为是检测asfv的金标准，广泛应用于临床样本的检测。但由于qpcr自身的限制，在对病毒载量较低的样本进行检测时，容易出现假阴性结果，导致不能及时切断传播源，造成asfv的进一步扩散。因此，如何实现低病毒含量样本中asfv的有效检测是防控asf的主要难点之一。
3、现有技术中，公开号为cn111850170a的专利技术专利公开了一种非洲猪瘟病毒微滴式数字pcr检测方法及其应用，该专利根据非洲猪瘟病毒核酸两段保守序列，设计后优选出三对引物和探针，建立非洲猪瘟病毒ddpcr检测方法，该方法未利用免疫磁珠来富集病毒，且检测限相对较高。
技术实现思路
1、有鉴于此，本专利技术的目的
2、为实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：
3、可识别asfv p72蛋白的单克隆抗体，所述单克隆抗体包括重链可变区和轻链可变区的互补决定区域；所述重链可变区的互补决定区域含有氨基酸序列如seq id no:1所示的vh-cdr1、氨基酸序列如seq id no:2所示的vh-cdr2和氨基酸序列如seq id no:3所示的vh-cdr3；所述轻链可变区的互补决定区域含有氨基酸序列如seq id no:4所示的vl-cdr1、氨基酸序列如seq id no:5所示的vl-cdr2和氨基酸序列如seq id no:6所示的vl-cdr3。
4、进一步，所述单克隆抗体的重链为igg1类抗体，轻链为kappa亚型。
5、本专利技术的目的之二在于提供一种含有前述单克隆抗体的免疫磁珠。
6、本专利技术的目的之三在于提供一种基于数字pcr方法检测asfv病毒的方法，该方法利用单抗磁珠对非洲猪瘟病毒进行富集，结合高灵敏度的数字pcr技术，可以实现低病毒含量样本的有效检测。
7、为实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：
8、基于数字pcr方法检测非洲猪瘟病毒的方法，所述方法为非疾病诊疗目的的方法，包括如下步骤：
9、(1)样本提取：利用前述免疫磁珠对待测样本中的非洲猪瘟病毒进行富集，并提取总基因组；
10、(2)pcr扩增：将步骤(1)提取得到的总基因组作为dna模板，利用pcr预反应体系进行扩增；所述pcr预反应体系含有核苷酸序列如seq id no:7-8所示的引物对和核苷酸序列如seq id no:9所示的探针；
11、(3)结果分析：利用液滴读数仪判断待测样本中是否含有非洲猪瘟病毒。
12、进一步，所述探针的3'端连接mgb基团，5'端连接fam基团。
13、进一步，步骤(1)具体为：
14、1)富集：将免疫磁珠与待测样本混合，获得富集asfv后的单抗磁珠；
15、2)裂解：使用磁力架分离磁珠与待测样本，采用dnase对分离后的磁珠进行处理；
16、3)总基因组提取：利用基因组提取试剂盒提取总基因组。
17、进一步，asfv富集体系如表1所示。
18、表1.asfv富集体系
19、 asfv富集体系的组份 1个检测反应的加入量 带有单克隆抗体的磁珠 10μl 待富集的液体样本 500μl 总计 510μl
20、进一步，asfv裂解体系如表2所示。
21、表2.裂解体系
22、 asfv富集体系的组份 1个检测反应的加入量 富集病毒后的单抗磁珠 10μl dnase(0.1u/μl) 200μl 总计 210μl
23、进一步，所述pcr预反应体系为20μl体系，包括10μl 2×ddpcr mix、0.5μl上游引物、0.5μl下游引物、0.5μl探针、2μl dna模板和6.5μl ddh2o。
24、作为优选，反应体系如表3所示。
25、表3反应体系
26、 预反应体系的组份 1个检测反应的加入量 2×ddpcr mix 10μl 引物(每条引物的含量为10μmol/l) 各0.5μl 探针(每条探针的含量为10μmol/l) 0.5μl dna模板(10-100ng) 本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.用于识别ASFV p72蛋白的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体包括重链可变区和轻链可变区的互补决定区域；所述重链可变区的互补决定区域含有氨基酸序列如SEQID NO:1所示的VH-CDR1、氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的VH-CDR2和氨基酸序列如SEQID NO:3所示的VH-CDR3；所述轻链可变区的互补决定区域含有氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示的VL-CDR1、氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示的VL-CDR2和氨基酸序列如SEQID NO:6所示的VL-CDR3。
2.含有权利要求1所述的单克隆抗体的免疫磁珠。
3.基于数字PCR方法检测非洲猪瘟病毒的方法，其特征在于，所述方法为非疾病诊疗目的的方法，包括如下步骤：
4.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述探针的3'端连接MGB基团，5'端连接FAM基团。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述PCR预反应体系为20μL体系，包括10μL2×ddPCR Mix、0.5μL上游引物、0.5μL下游引物、0.5μL探针、2μL DNA
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，PCR扩增程序为：50℃反应2min；95℃预变性10min；95℃变性30s，60℃退火1min，循环40次；1个酶失活循环，98℃反应10min。
7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述待测样本为环境样本，所述环境样本包括猪舍地面、墙面和食槽拭子、养殖用水、养殖饲料、猪唾液、猪尿液、猪粪便中的任一种或多种。
8.用于检测非洲猪瘟病毒的组合物，其特征在于，所述组合物包括用于检测非洲猪瘟病毒的引物对和探针；所述引物对由核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示的下游引物组成，所述探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示。
9.权利要求1所述的单克隆抗体、权利要求2所述的免疫磁珠和/或权利要求9所述的组合物在制备用于检测非洲猪瘟病毒的试剂盒中的应用。
10.用于检测非洲猪瘟病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有权利要求1所述的单克隆抗体、权利要求2所述的免疫磁珠、权利要求9所述的组合物中的任一种或多种。
...【技术特征摘要】
1.用于识别asfv p72蛋白的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体包括重链可变区和轻链可变区的互补决定区域；所述重链可变区的互补决定区域含有氨基酸序列如seqid no:1所示的vh-cdr1、氨基酸序列如seq id no:2所示的vh-cdr2和氨基酸序列如seqid no:3所示的vh-cdr3；所述轻链可变区的互补决定区域含有氨基酸序列如seq id no:4所示的vl-cdr1、氨基酸序列如seq id no:5所示的vl-cdr2和氨基酸序列如seqid no:6所示的vl-cdr3。
2.含有权利要求1所述的单克隆抗体的免疫磁珠。
3.基于数字pcr方法检测非洲猪瘟病毒的方法，其特征在于，所述方法为非疾病诊疗目的的方法，包括如下步骤：
4.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述探针的3'端连接mgb基团，5'端连接fam基团。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述pcr预反应体系为20μl体系，包括10μl2×ddpcr mix、0.5μl上游引物、0.5μl下游引物、0.5μl探针、2μl dna模板和...
【专利技术属性】
技术研发人员：杨睿，付利芝，付文贵，王孝友，张邑帆，杨柳，
申请(专利权)人：重庆市畜牧科学院，
类型：发明
国别省市：
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