【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及检测分析，尤其涉及一种细胞及其培养基中糖代谢产物的液质联用检测分析方法。
技术介绍
1、提供以下描述本专利技术背景的信息以帮助理解本专利技术，并且不被认为构成或描述了本专利技术的现有技术。
2、近年来心血管疾病(cardiovascular disease，cvd)的诊断和治疗取得了很大进展，但cvd仍然是全球发病和死亡的主要原因。大多数cvd事件、中风和外周动脉疾病的病理原因是动脉粥样硬化。动脉粥样硬化(atherosclerosis,as)为脂质蓄积驱动的慢性炎症性疾病，是冠心病、脑梗死以及外周血管疾病的共同病理学基础，严重危害人类健康。研究表明，血管内皮细胞(endothelial cells,ecs)功能障碍是as的始动环节；血管平滑肌细胞(vscular smooth muscle cells,vsmcs)的异常增殖促进as斑块的形成和发展，并且和斑块的稳定性密切相关。研究结果提示在病理条件下，ecs和vsmcs能量代谢异常与as病变密切相关。
3、细胞能量代谢是细胞功能实现的重要基础，细胞必须通过能量代谢维持生命。正常细胞在缺氧条件下主要通过糖酵解提供能量，而在有氧条件下主要通过线粒体产生atp提供能量。线粒体是细胞的能量工厂，同时也是真核生物进行氧化代谢的主要部位，是糖类、脂肪和氨基酸最终氧化释放能量的地方。能量代谢包括糖代谢、脂肪代谢、氨基酸代谢，其中糖代谢是最主要的能量代谢方式。流行病学研究显示糖代谢异常可以显著增加心血管事件的风险，与ecs功能障碍、vsmcs过度增殖密切
4、由于常规检测分析仅能够实现对与糖代谢相关的单种成分或者少数几种成分的定量分析，工作量大，效率低。同时分析生物样品中有机酸的经典方法是使用gc-ms或者hplc-ms对分析物进行衍生化。然而在处理大量样品且样品体积非常小(2-10ul)时，最好避免对其进行衍生化。因此需要一种可靠且可重现的方法，并能通过一步法，无需对样品衍生化，实现对核心糖代谢产物的批量分析检测(例如乳酸、丙酮酸、三羧酸循环中间产物、己糖胺途径中间产物等)。
5、根据不同糖代谢途径和相关的代谢中间产物，本方法选用了其中共四类9种代谢中间产物。葡萄糖代谢：葡萄糖-6-磷酸；糖酵解途径：乳酸、果糖-1，6-二磷酸；三羧酸循环(tca循环)：丙酮酸、苹果酸、α-酮戊二酸、谷氨酸；己糖胺途径(hbp途径)：udp-glcnac；唾液酸代谢途径：sa。由于糖代谢中间产物的极性均比较强，且易电离，很难被反相色谱柱固定相吸附和保留。为了提高色谱柱对目标化合物的保留能力，本专利技术使用acquity uplc hsst3柱，以不同比例的水/乙腈作为流动相，将离子对试剂乙基二丁基铵和醋酸铵加入到流动相中进行梯度洗脱。所描述的方法可以在单次进样中检测经典动脉粥样硬化模型(缺氧内皮损伤模型、平滑肌细胞增殖模型)中的相关糖代谢产物(乳酸、丙酮酸、tca循环中间产物、hbp途径产物等)的变化情况,，不需要对样品进行衍生化处理，同时也适用于其他不同细胞疾病模型的代谢组研究。
技术实现思路
1、本专利技术的目的是提供一种液质联用一步法测定动脉粥样硬化模型细胞和细胞培养基中相关糖代谢产物(乳酸、丙酮酸、tca循环中间产物、hbp途径产物等)的方法，用于准确、快速地评价动脉粥样硬化模型下细胞中糖代谢产物的变化规律。
2、本专利技术采用的技术方案如下：
3、一种液质联用一步法测定细胞和细胞培养基中相关糖代谢产物(乳酸、丙酮酸、tca循环中间产物、hbp途径产物等)的方法，包括如下步骤：
4、(1)标准样品制备：精密称取丙酮酸、乳酸、苹果酸、d-葡萄糖-6-磷酸钠盐、果糖-1，6-二磷酸钠盐、α-酮戊二酸、谷氨酸、udp-glcnac、唾液酸配置最终浓度为10mg/ml的化合物储备液。将各个化合物的储备液用超纯水稀释为1mg/ml的次级化合物储备液。从每种化合物储备液中各取50ul，加超纯水补充为1ml的混合工作液，最终各化合物的浓度为50ug/ml。用流动相a+b混合溶液稀释混合工作液，配置一系列不同浓度的标准溶液(5、10、25、50、100、250、500、1000、2500、5000、10000、25000、50000ng/ml)。
5、(2)细胞培养基样品前处理：取细胞培养基100ul，加入400ul二氯甲烷，室温震荡10min后，13000rpm离心10min。取上层水相。
6、(3)细胞样品前处理：将接种有细胞的6cm小皿中的培养基倒掉，pbs清洗两遍。用胰蛋白酶消化细胞，收集细胞悬液，pbs缓冲液清洗重悬。1000g室温离心5min，去除pbs上清，收集细胞。细胞中加入100ul流动相a+b混合液重悬，用超声波细胞破碎仪以30％功率，3秒3次，每次间隔3秒的程序，充分破碎细胞。将破碎好的细胞悬液以13000rpm，4℃离心10min。取上清液100ul，加入400ul二氯甲烷，室温震荡10min后，13000rpm离心10min。取上层水相，用流动相a+b混合液稀释10倍。
7、(4)标准曲线绘制：将步骤(1)得到的混合标准溶液进行液质联用结束分析测定，分别以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，制作标准曲线。
8、(5)定量分析：取待测样品，按照步骤(2)、(3)的方法处理，并按照步骤(4)所得的标准曲线方程计算，得到待测样品中相关糖代谢产物(乳酸、丙酮酸、tca循环中间产物、hbp途径产物等)的浓度。
9、优选地，本专利技术步骤(4)中所述液质联用检测的液相色谱条件为：色谱柱为acquity uplc hss t3色谱柱，规格为2.1mm×150mm，孔径为1.8um；流动相a为含有0.5mm醋酸铵和1.5mm dbaa的5％乙腈水溶液，流动相b为含0.5mm醋酸铵和6mm dbaa的85％乙腈水溶液；采用梯度洗脱方法；每次进样量为2ul。
10、优选地，采用流速为0.2ml/min，所述梯度洗脱的条件为：
11、
12、
13、优选地，本专利技术步骤(4)中所述液质联用检测的mrm扫描参数包括：
14、苹果酸的离子对为133.1/115.1(碎裂电压为70，碰撞能量为10v)、133.1/71(碎裂电压为70，碰撞能量为15v)；
15、乳酸的离子对为89/45(碎裂电压为60，碰撞能量为10v)、89/43(碎裂电压为60，碰撞能量为10v)；
16、葡萄糖-6-磷酸的离子对为259.1/97.1(碎裂电压为90，碰撞能量为20v)、259.1/79.1(碎裂电压为90，碰撞能量为20v)；
17、丙酮酸的离子对为87/43(碎裂电压为50，碰撞能量为5v)；
18、果糖-1，6-二磷酸的离子对为339.1/241.1(碎裂电压本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种通过液相-质谱联用检测方法确定动脉粥样硬化模型样品中相关糖代谢产物(乳酸、丙酮酸、TCA循环中间产物、HBP途径产物等)的存在、不存在或量的方法。所述糖代谢分析物选丙酮酸、乳酸、苹果酸、D-葡萄糖-6-磷酸钠盐、果糖-1，6-二磷酸钠盐、α-酮戊二酸、谷氨酸、UDP-GlcNAc、唾液酸及其组合组成的组。其特征在于，具体实验步骤包括：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述液质联用检测的液相色谱条件包括：
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的分析物的质谱质谱条件包括：使用三重四极杆质谱，以负模式运行。采用ESI离子源和MRM扫描模式。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的分析物的质谱MRM扫描参数包括：
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述质谱干燥器温度为350℃，雾化器压力为20psi，干燥器流量为10I/min，鞘气温度为350℃，鞘气流量11I/min，毛细管电压为3500V。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述样品选细胞培养基上清、细胞组成的组。>
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述样品的制备方法包括如下步骤：
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述离心的速度为12000
...【技术特征摘要】
1.一种通过液相-质谱联用检测方法确定动脉粥样硬化模型样品中相关糖代谢产物(乳酸、丙酮酸、tca循环中间产物、hbp途径产物等)的存在、不存在或量的方法。所述糖代谢分析物选丙酮酸、乳酸、苹果酸、d-葡萄糖-6-磷酸钠盐、果糖-1，6-二磷酸钠盐、α-酮戊二酸、谷氨酸、udp-glcnac、唾液酸及其组合组成的组。其特征在于，具体实验步骤包括：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述液质联用检测的液相色谱条件包括：
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的分析物的质谱质谱条件包括：使用三重四极杆质谱，以负模式运行。采用esi离子源和mr...
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