【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于荧光成像及生物传感，涉及一种检测去甲肾上腺素和肾上腺素的新型荧光探针、荧光探针制备方法及其在细胞成像与生物传感中的应用。
技术介绍
1、去甲肾上腺素、肾上腺素既是人体中的激素，也是中枢神经系统中的关键单胺类神经递质，在脑神经信号传递过程中发挥着重要作用。去甲肾上腺素主要由交感节后神经元和脑内去甲肾上腺素能神经元合成和分泌，肾上腺素则由肾上腺释放。它们对生命过程是至关重要的。然而，去甲肾上腺素和肾上腺素的代谢异常会导致神经信号的紊乱，并且与各种精神疾病和神经退行性疾病密切相关，如阿兹海默症，帕金森症。此外，分泌过多还会造成血压升高、心率增快、心脏收缩力增强、内脏血管扩张、皮肤粘膜的血管收缩以及低钾血症等。
2、目前有很多方法用于去甲肾上腺素和肾上腺素检测，比如质谱成像法、电化学法、拉曼光谱法和荧光光谱法等。在这些已发展的方法中，荧光法具有高灵敏度、简单并且仪器成本低等特点，使得基于荧光的方法在应用前景方面展现出明显优势。目前对于神经递质检测存在的巨大挑战是神经递质结构极其相似，难以实现细胞内特异性区分。若要实现在细胞、活体中对去甲肾上腺素和肾上腺素的精确检测，则需要探针具有很高的选择性和较低的信号干扰。因此，发展一种能实现细胞、活体中去甲肾上腺素和肾上腺素精确检测的探针是具有挑战性的。
技术实现思路
1、本专利技术提供一种检测去甲肾上腺素、肾上腺素的新型荧光探针及其制备方法以及其在细胞成像与生物传感中的应用，其具有选择性好、生物毒性小等优点。
2
3、本专利技术提供的超分子荧光探针canqb，是一种具有三元自组装结构的超分子荧光探针canqb。所述超分子荧光探针canqb可以对细胞内的去甲肾上腺素进行定量检测，具有良好的选择性、生物毒性小。
4、具体地，其为包含葫芦脲[10]、吖啶橙ao、小分子探针nqb的混合水溶液。
5、其中，所述小分子探针nqb如以下式(6)所示：
6、
7、其中，葫芦脲[10]，是指由甘脲和甲醛缩合而成的一类大环分子，其内疏水、外亲水，且空腔中间大、两端小，具有高度的对称性。葫芦脲[10](cb[10])是由10个甘脲单元连成的，结构式如下式(18)所示：
8、
9、其中，吖啶橙ao，化学名称为3,6-二(二甲基胺)吖啶，结构式如下式(19)所示：
10、
11、其中，本专利技术提供的超分子荧光探针cmnbf，是一种具有三元自组装结构的超分子荧光探针cmnbf。所述超分子荧光探针cmnbf可以对细胞内的肾上腺素进行定量检测，具有良好的选择性、生物毒性小。
12、具体地，其为包含葫芦脲[10]，亚甲蓝mb、小分子探针nbf的混合水溶液。
13、其中所述小分子探针nbf如以下式(17)所示：
14、
15、其中，葫芦脲[10]，是指由甘脲和甲醛缩合而成的一类大环分子，其内疏水、外亲水，且空腔中间大、两端小，具有高度的对称性。葫芦脲[10](cb[10])是由10个甘脲单元连成的，结构式如下式(18)所示：
16、
17、其中，亚甲蓝mb，是一种吩噻嗪盐，结构式如下式(20)所示：
18、
19、本专利技术还提供了小分子荧光探针的制备方法，包括如式(6)所示小分子探针nqb的制备方法、如式(17)所示小分子荧光探针nbf的制备方法，具体如下：
20、(1)小分子荧光探针nqb的制备
21、(1-1)在1,4-环氧六烷中，式(1)4-溴-1,8-萘二甲酸酐与联硼酸频哪醇酯进行过夜回流(第一反应)，得到白色固体式(2)所示的4-硼酸频哪醇酯-1,8-萘二甲酸酐，所述反应过程如下反应式(a)所示：
22、
23、步骤(1-1)中，所述第一反应的温度为100-120℃；优选地，为120℃。
24、步骤(1-1)中，所述第一反应的时间为10-12h；优选地，为12h。
25、步骤(1-1)中，所述第一反应优选地在氮气氛围下进行。
26、步骤(1-1)中，所述4-溴-1,8-萘二甲酸酐与联硼酸频哪醇酯的摩尔比为(2-3)：(3-4)，优选地，为2：3。
27、(1-2)在乙醇中，4-甲氨基吡啶和式(2)所示的4-硼酸频哪醇酯-1,8-萘二甲酸酐进行过夜回流(第二反应)，得到黄色固体式(3)所示的化合物，所述反应过程如下反应式(b)所示：
28、
29、步骤(1-2)中，所述乙醇，优选地，为无水乙醇。
30、步骤(1-2)中，所述第二反应的温度为90-100℃；优选地，为90℃。
31、步骤(1-2)中，所述第二反应的时间为10-12h；优选地，为12h。
32、步骤(1-2)中，所述式(2)所示的4-硼酸频哪醇酯-1,8-萘二甲酸酐和4-甲氨基吡啶的摩尔比为(4-5)：(5-6)，优选地，为4：5。
33、(1-3)在丙酮或乙腈中，对羟基苯甲醛与1，4-二溴丁烷进行过夜回流(第三反应)，得到无色固体式(4)所示的化合物，所述反应过程如反应式(c)所示：
34、
35、在丙酮或乙腈中，式(3)所示的化合物和式(4)所示的化合物进行过夜回流(第四反应)，得到绿色固体式(5)所示的化合物，所述反应过程如下反应式(d)所示：
36、
37、步骤(1-3)中，所述第三反应的温度为70-90℃；优选地，为80℃。
38、步骤(1-3)中，所述第三反应的时间为10-12h；优选地，为12h。
39、步骤(1-3)中，所述对羟基苯甲醛和1，4-二溴丁烷的摩尔比为(1-2)：(2-3)；优选地，为1：2。
40、步骤(1-3)中，所述第四反应的温度为100-120℃；优选地，为120℃。
41、步骤(1-3)中，所述第四反应的时间为10-12h；优选地，为12h。
42、步骤(1-3)中，式(3)所示的化合物和式(4)所示的化合物的摩尔比为(2-3)：(4-5)；优选地，为3：5。
43、(1-4)在四氢呋喃和水的混合溶液中，式(5)所示的化合物和高碘酸钠、盐酸搅拌反应(第五反应)，得到橙色固体式(6)所示的化合物，即小分子荧光探针nqb，所述反应过程如下反应式(e)所示：
44、
45、步骤(1-4)中，所述第五反应的温度为20-30℃；优选地，为25℃。
46、步骤(1-4)中，所述第五反应的时间为10-12h；优选地，为12h。
47、步骤(1-4)中，所述式(5)所示的化合物和高碘酸钠的摩尔比为(1-2)：(4-5)；优选地，为1：4。
48、步骤(1-4)中，所述盐酸用于提供酸性环境，促进硼酸酯的水本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种识别去甲肾上腺素、肾上腺素的小分子荧光探针，其特征在于，其分别为如式(6)所示的小分子探针NQB、如式(17)所示的小分子荧光探针NBF；
2.一种超分子荧光探针CANQB、CMNBF，其特征在于，
3.一种如权利要求1所述小分子荧光探针的制备方法，其特征在于，所述方法分别为如式(6)所示小分子探针NQB的制备方法、如式(17)所示小分子荧光探针NBF的制备方法：
4.一种如权利要求2所述超分子荧光探针CANQB、CMNBF的制备方法，其特征在于，所述方法分别为超分子荧光探针CANQB的制备方法、超分子荧光探针CMNBF的制备方法：
5.如权利要求3、4所述的方法，其特征在于，
6.一种如权利要求3、4之任一项所述方法制备得到的小分子探针NQB、NBF和/或超分子荧光探针CANQB、CMNBF。
7.如权利要求1的小分子探针NQB、NBF，如权利要求2所述的超分子荧光探针CANQB、CMNBF，如权利要求6所述的小分子探针NQB、NBF和/或超分子荧光探针CANQB、CMNBF在体外和/或细胞内和/或
8.一种体外去甲肾上腺素、肾上腺素的荧光检测方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：在缓冲液中，将权利要求2所述的超分子荧光探针CANQB与去甲肾上腺素混合摇匀进行反应，在激发波长350nm下测定探针荧光强度，从而实现对去甲肾上腺素的定量检测；或将权利要求2所述的超分子荧光探针CMNBF与肾上腺素混合摇匀进行反应，在激发波长495nm下测定探针荧光强度，从而实现对肾上腺素的定量检测。
9.一种体外去甲肾上腺素的双光子检测方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：在缓冲液中，将权利要求2所述的超分子荧光探针CANQB与去甲肾上腺素混合摇匀进行反应，利用激发波长为720nm的双光子荧光激发，测定溶液的荧光强度，随着加入体积的增加，470nm通道的荧光强度逐渐降低，而540nm通道的荧光强度不变，与单光子检测时相同，有良好的线性，从而实现对去甲肾上腺素的定量检测。
10.一种在细胞内去甲肾上腺素、肾上腺素的荧光成像方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：将细胞与权利要求2所述的超分子荧光探针CANQB共同孵育，加入缓冲液后，利用共聚焦显微镜进行观察，用激发波长为720nm的双光子荧光激发，观察细胞发射的双光子荧光，随着去甲肾上腺素的不断增加，细胞中470nm通道的荧光强度逐渐降低，而540nm通道的荧光强度不变，从而实现对细胞内去甲肾上腺素的双光子荧光变化进行成像分析；或将细胞与权利要求2所述的超分子荧光探针CMNBF共同孵育，加入缓冲液后，利用共聚焦显微镜进行观察，用激发波长为488nm的荧光激发，观察细胞发射的荧光，随着肾上腺素的不断增加，细胞中570nm通道的荧光强度逐渐降低，而695nm通道的荧光强度不变，从而实现对细胞内肾上腺素的荧光变化进行成像分析。
...【技术特征摘要】
1.一种识别去甲肾上腺素、肾上腺素的小分子荧光探针，其特征在于，其分别为如式(6)所示的小分子探针nqb、如式(17)所示的小分子荧光探针nbf；
2.一种超分子荧光探针canqb、cmnbf，其特征在于，
3.一种如权利要求1所述小分子荧光探针的制备方法，其特征在于，所述方法分别为如式(6)所示小分子探针nqb的制备方法、如式(17)所示小分子荧光探针nbf的制备方法：
4.一种如权利要求2所述超分子荧光探针canqb、cmnbf的制备方法，其特征在于，所述方法分别为超分子荧光探针canqb的制备方法、超分子荧光探针cmnbf的制备方法：
5.如权利要求3、4所述的方法，其特征在于，
6.一种如权利要求3、4之任一项所述方法制备得到的小分子探针nqb、nbf和/或超分子荧光探针canqb、cmnbf。
7.如权利要求1的小分子探针nqb、nbf，如权利要求2所述的超分子荧光探针canqb、cmnbf，如权利要求6所述的小分子探针nqb、nbf和/或超分子荧光探针canqb、cmnbf在体外和/或细胞内和/或活体内检测去甲肾上腺素、肾上腺素中的应用、或在细胞成像与生物传感中的应用。
8.一种体外去甲肾上腺素、肾上腺素的荧光检测方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：在缓冲液中，将权利要求2所述的超分子荧光探针canqb与去甲肾上腺素混合摇匀进行反应，在激发波长350nm下测定探针荧光强度，...
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