【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于绒促性素生产，涉及一种用于规模化生产的绒促性素提纯方法。
技术介绍
1、绒促性素是从正常孕妇尿中提取纯化所得的一种糖蛋白激素。绒促性素首先是由zended和asehhein于1927年在孕妇尿中发现。1936年erown和venning发现在妊娠第60-80天尿中绒促性素分泌量达到最大值。
2、绒促性素是由α、β两个亚基组成，以共价键结合。α亚基由92个氨基酸组成，β亚基由145个氨基酸组成，其α亚基与其它非蛋白质激素和fsh、lh、tsh等α亚基非常相似，但α亚基不表现为生物功能，它的β亚基差异则较大，正是由于这些差异，决定了这几种激素各自的生物功能和免疫特性。
3、绒促性素等电点为2.95，分子中含有33％的糖。它包括半乳糖5.2-5.7％；甘露糖5.2-5.7％；岩藻糖1.0％；n-乙酰葡萄糖胺11.4-11.6％；n-乙酰半乳糖胺2.8-2.9％，以及唾液酸8.3-8.4％。糖含量与绒促性素生物活性呈正相关，糖含量越多，生物活性越高。特别是唾液酸对绒促性素的生物活性最为关键，当唾液酸含量损失0.3％时，生物活力则从18800iu/mg下降到11800iu/mg。绒促性素的分子量用葡萄糖凝胶过滤测定为59000±4000，用沉淀平衡法测定为47000±3000，从化学组成平均计算最小分子量为27000。
4、绒促性素为白色或类白色粉末，极易溶于水和甘油，不溶于乙醇、丙酮、乙醚等有机溶剂中，在中性或微酸性溶液中可以被70％乙醇和丙酮所沉淀，也可被磷酸所沉淀，但不能被三氯醋酸、
5、随着研究的深入和技术的发展，研究者应用吸附剂(如人造沸石、苯甲酸、高岭土等)和离子交换吸附法取得绒促性素，然后再用各种纯化方法进行纯化，目前工业生产的绒促性素纯度在4500iu/mg左右，科研水平已达到18800iu/mg以上。
6、中国专利申请文件(cn114591414a)公开了一种人绒毛膜促性腺激素的制备方法，其以hcg粗制品为起始原料依次采用染料亲和层析、阴离子交换层析以及凝胶层析工艺，但是其从粗品开始提取，用到3种层析交换，层析步骤繁琐，且填料成本很高，工艺无法放大应用于大规模生产，仅限于实验室小试研究。
7、中国专利申请文件(cn111233999a)公开了一种从人尿中提取人绒毛膜促性腺激素的方法，其从人尿中提取人绒毛膜促性腺激素的方法，采用阴离子交换树脂作为吸附剂，加入到孕妇尿液中进行搅拌、过滤、洗涤，通过乙酸铵溶液进行洗脱,然后对洗脱液进行沉淀,收集沉淀以及测定效价，得到人绒毛膜促性腺激素。但是其获得产品单位效价仅有200iu左右/mg，纯度相对较差，而且其利用阴离子交换树脂吸附尿液时填料用量大，如放大到生产规模，会大幅增加成本。
8、中国专利申请文件(114835796a)公开了一种促性腺激素纯化方法，其以绒促性素粗品为原料大幅提高了原料成本；且利用亲和与阳离子两步层析进行纯化，规模化生产时亲和填料投入成本也大大提高，并不适用于大规模的工业生产。
技术实现思路
1、本专利技术的目的是针对现有技术存在的上述问题，提出了一种制备周期短、物料投入少、产品纯度高的用于规模化生产的绒促性素提纯方法。
2、本专利技术的目的可通过下列技术方案来实现：一种用于规模化生产的绒促性素提纯方法，所述方法包括：将孕妇尿液经超滤、洗滤得浓缩液，再进行醇沉，然后干燥得绒促性素粗品，对绒促性素粗品依次进行前处理、阳离子复合疏水层析、超滤浓缩脱盐得绒促性素产品液，最后进行冷冻干燥得绒促性素原料药。
3、作为优选，孕妇尿液为茶色、稠度均匀的液体，搅动后泡沫小且为白色，比重约为1.01～1.03，ph为5.0～6.5。
4、在上述的一种用于规模化生产的绒促性素提纯方法中，经超滤后孕妇尿液体积浓缩35-45倍。通过超滤和洗滤后除去了大量低分子量杂质，同时极大地缩小了尿液体积，可以大幅减少后续工艺的物料使用量及时间。
5、作为优选，超滤前用0.2-2μm的pes滤芯进行微滤，再用10kd的超滤膜包进行超滤浓缩，浓缩至原料液体积的1/(35-45)，再加入等体积注射用水，洗滤1-5次，最终得到体积为1/(35-45)的超滤浓缩液。
6、在上述的一种用于规模化生产的绒促性素提纯方法中，醇沉具体为：在浓缩液中加入0.3-0.8wt％的可溶性盐，再加入乙醇直至乙醇浓度达到70-85v％，最后虹吸、离心收集沉淀。
7、作为优选，可溶性盐为钠盐、铵盐、钙盐中的至少一种。本专利技术通过可溶性盐保护蛋白性状，进一步促进蛋白沉淀。
8、本专利技术通过超滤浓缩和洗滤，极大地缩小了料液体积，同时过滤掉小分子杂质，进一步对料液中的hcg进行了纯化和富集，减少后续工艺的物料使用量及时间。再经过醇沉的作用进一步除去可溶性盐等小分子物质，同时使hcg析出沉淀，干燥后得绒促性素粗品(效价100iu/mg)。
9、作为优选，阳离子复合疏水层析填料为agarosix mc90-mmc。本专利技术利用agarosixmc90-mmc填料一步层析，即可实现离子交换层析和疏水层析两种原理对hcg进行纯化，效果相比于常规单一离子层析大幅提升。
10、在上述的一种用于规模化生产的绒促性素提纯方法中，前处理具体包括如下步骤：
11、s1、取绒促性素粗品溶于第一缓冲液，然后离心收集上清液；
12、s2、上清液边搅拌边滴加乙醇，直至乙醇含量达到65-80v％，然后静置，离心收集沉淀；
13、s3、将沉淀溶于第二缓冲液，然后离心收集上清液；
14、s4、上清液边搅拌边滴加乙醇，直至乙醇含量达到65-80v％，然后静置，离心收集沉淀。
15、在上述的一种用于规模化生产的绒促性素提纯方法中，第一缓冲液ph为6-7，包括：0.03-0.08m乙酸铵，0.03-0.08m氯化钠，50-55v％乙醇。
16、在上述的一种用于规模化生产的绒促性素提纯方法中，第二缓冲液ph为3.5-4.5，包括：0.1-0.2m乙酸钙，0.1-0.2m氯化钠，60-65v％乙醇。
17、作为优选，步骤s1和步骤s3离心采用大型平板沉降离心机。大幅提高离心效率，适用于大规模工业生产。
18、本专利技术在粗品的基础上，通过前处理进一步除去杂质，提纯产品，可得到效价约800iu/mg的绒促性素中间体。本专利技术通过第一缓冲液和第二缓冲液不断提高盐浓度和降低ph，从而分段沉淀并去除杂蛋白，进一步分离纯化目的蛋白。
19、在上述的一种用于规模化生产的绒促性素提纯方法中，阳离子复合疏水层析包括如下步骤：将前处理后的绒促性素上样至agarosix mc90-mmc，然后用缓冲液洗脱，收集洗脱峰溶液。
20、在上述的一种用于规模化生产的绒促性素提纯方法中，所述缓冲液洗脱包括以下步骤：
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【技术保护点】
1.一种用于规模化生产的绒促性素提纯方法，其特征在于，所述方法包括：将孕妇尿液经超滤、洗滤得浓缩液，再进行醇沉，然后干燥得绒促性素粗品，对绒促性素粗品依次进行前处理、阳离子复合疏水层析、超滤浓缩脱盐得绒促性素产品液，最后进行冷冻干燥得绒促性素原料药。
2.根据权利要求1所述的一种用于规模化生产的绒促性素提纯方法，其特征在于，经超滤后孕妇尿液体积浓缩35-45倍。
3.根据权利要求1所述的一种用于规模化生产的绒促性素提纯方法，其特征在于，醇沉具体为：在浓缩液中加入0.3-0.8wt％的可溶性盐，再加入乙醇直至乙醇浓度达到70-85v％，最后虹吸、离心收集沉淀。
4.根据权利要求1所述的一种用于规模化生产的绒促性素提纯方法，其特征在于，前处理具体包括如下步骤：
5.根据权利要求4所述的一种用于规模化生产的绒促性素提纯方法，其特征在于，第一缓冲液pH为6-7，包括：0.03-0.08M乙酸铵，0.03-0.08M氯化钠，50-55v％乙醇。
6.根据权利要求4所述的一种用于规模化生产的绒促性素提纯方法，其特征在于，第二缓冲液p
7.根据权利要求1所述的一种用于规模化生产的绒促性素提纯方法，其特征在于，阳离子复合疏水层析包括如下步骤：将前处理后的绒促性素上样至Agarosix MC90-MMC，然后用缓冲液洗脱，收集洗脱峰溶液。
8.根据权利要求5所述的一种用于规模化生产的绒促性素提纯方法，其特征在于，所述缓冲液洗脱包括以下步骤：
9.根据权利要求1所述的一种用于规模化生产的绒促性素提纯方法，其特征在于，超滤浓缩脱盐后绒促性素产品液电导为(3-10)ms/cm。
10.根据权利要求1所述的一种用于规模化生产的绒促性素提纯方法，其特征在于，冷冻干燥具体包括：将绒促性素产品液降温1-2h至-40℃以下，然后抽真空13-16Pa升华4-8h至-(5-15)℃，抽真空8-12Pa升华至18-22℃，保温1-3h，再升温5-8h至28-35℃，得到绒促性素原料药。
...【技术特征摘要】
1.一种用于规模化生产的绒促性素提纯方法，其特征在于，所述方法包括：将孕妇尿液经超滤、洗滤得浓缩液，再进行醇沉，然后干燥得绒促性素粗品，对绒促性素粗品依次进行前处理、阳离子复合疏水层析、超滤浓缩脱盐得绒促性素产品液，最后进行冷冻干燥得绒促性素原料药。
2.根据权利要求1所述的一种用于规模化生产的绒促性素提纯方法，其特征在于，经超滤后孕妇尿液体积浓缩35-45倍。
3.根据权利要求1所述的一种用于规模化生产的绒促性素提纯方法，其特征在于，醇沉具体为：在浓缩液中加入0.3-0.8wt％的可溶性盐，再加入乙醇直至乙醇浓度达到70-85v％，最后虹吸、离心收集沉淀。
4.根据权利要求1所述的一种用于规模化生产的绒促性素提纯方法，其特征在于，前处理具体包括如下步骤：
5.根据权利要求4所述的一种用于规模化生产的绒促性素提纯方法，其特征在于，第一缓冲液ph为6-7，包括：0.03-0.08m乙酸铵，0.03-0.08m氯化钠，50-55v％乙醇。
6.根据权利要求4所述的一种用...
【专利技术属性】
技术研发人员：于钢，俞通泰，沙乐，
申请(专利权)人：甘肃天祁生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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