【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于细胞生物学和免疫学，具体涉及一种可诱发自崩解型人工抗原呈递细胞及其制备方法和应用。
技术介绍
1、近年来，在体外诱导活化的免疫细胞（t细胞、nk细胞等）用于过继性免疫治疗成为热点，其中，免疫细胞的活化和增殖效果能决定过继后的免疫细胞能否在体内持续存在，是影响治疗效果的关键步骤。
2、无论是在体内和体外，t细胞的活化均需要tcr-cd3复合物以及共刺激分子的双信号刺激。cd3抗体可提供非特异性的第一信号，可引起t细胞tcr-cd3复合体的形成，产生活化信号，刺激t细胞活化增殖。提供第二信号的分子通常称为共刺激分子，例如，cd28抗体已充分被证实是经由tcr/cd3激活t细胞的最重要共刺激分子。在tcr被cd3抗体预激活的细胞中，cd28抗体与配体结合后，诱导t细胞内酪氨酸磷酸化，使t细胞充分活化。缺乏cd28共刺激信号会导致t细胞使能，其在启动免疫应答初始阶段起着不可或缺的作用。
3、目前，体外扩增t细胞的方法主要是用包被抗cd3和抗cd28抗体的板子激活t细胞或用前述抗体包被的免疫磁珠刺激t细胞之后，添加辐照灭活后的抗原递呈细胞作为饲养细胞，加入t细胞培养体系中，从而活化和扩增t细胞。
4、从人外周血分离得到的pbmc是一种专职抗原递呈细胞，经过辐照灭活后可作为t细胞或nk细胞的饲养细胞，但该技术存在如下问题：
5、（1）因pbmc来源的细胞成分并不单一，各种细胞表面表达的信号都不一致，不仅仅是有促进t细胞和nk细胞增殖的信号能够被传递，一些对t细胞和nk细胞增殖和活
6、（2）供者差异而导致的pbmc细胞品质差异对所刺激的免疫细胞（t细胞、nk细胞）品质稳定性会有直接影响；
7、（3）pbmc采集依赖于cro以及对接医院对志愿者血样的采集，在不能穷举病原体的情况下，有可能导入人源未知病原体的污染；
8、（4）除了做表面hla分型鉴定外，通过简单的流式细胞计数很难鉴别额外添加的pbmc残留，在质量控制上造成很多困难。
9、显然，从外周血分离得到的天然抗原递呈细胞无论从效果还是安全角度，都不适合于免疫细胞治疗技术的开发。
10、为了获得刺激效果较为稳定、刺激更为高效的饲养细胞，人工抗原呈递细胞（artificial antigen presenting cell, aapc）平台已替代pbmc作为饲养细胞，用于体外刺激和扩增t细胞或nk细胞，在制备抗癌细胞治疗药物的研究中已广泛应用。
11、k562细胞作为细胞骨架，通常用于aapc的构建。然而，现有在k562上展示cd64和cd137l等刺激蛋白的现有aapc制备技术，需要辐照确保崩解才能添加到免疫细胞培养体系中，如果发生意外导致辐照剂量不足，崩解不完全，则极容易导致aapc活细胞残留，产生致瘤风险，严重影响细胞治疗产品的纯度和安全性。
技术实现思路
1、为了解决现有技术的上述问题，本专利技术提供了一种可诱发自崩解型人工抗原呈递细胞，可作为免疫细胞的饲养细胞，在促进免疫细胞增殖和活化的同时加速自身崩解的特点，能够提高相关免疫细胞的产品纯度和安全性。
2、为了解决现有技术问题，本专利技术采用的技术方案如下：
3、一种可诱发自崩解型人工抗原呈递细胞，所述可诱发自崩解型人工抗原呈递细胞为表达fc受体融合蛋白和共刺激分子配体的人工抗原呈递细胞，所述fc受体融合蛋白包括胞外段、跨膜段和胞内段，所述胞外段为fc受体胞外段，胞内段含有细胞凋亡受体分子全部或功能片段，所述fc受体融合蛋白用于锚定免疫刺激分子配体。
4、在本专利技术一些实施例中，所述fc受体融合蛋白的胞外段选择cd64、cd32a、cd32b、cd16a、cd16b、cd89、cd23、cd351、新生儿fc受体胞外段中的一种；所述fc受体融合蛋白的跨膜段为i型跨膜蛋白，选自d2、cd7、cd8、cd11、cd25、cd27、cd28、cd95、cd96、cd158、cd169、cd226、cd 335、cd 336、cd337、ox40、tlr1、tlr2中的一种的跨膜区和胞内区；所述fc受体融合蛋白的胞内段含有细胞凋亡受体分子cd95或cd7全部或功能片段。
5、在本专利技术一些实施例中，所述fc受体融合蛋白具体为cd64-cd7、cd64-cd95或cd64-cd169融合蛋白，所述cd64-cd7融合蛋白的氨基酸序列如seq id no.1或seq id no.2所示，所述cd64-cd95融合蛋白的氨基酸序列如seq id no.3或seq id no.4所示，所述cd64-cd169融合蛋白如seq id no.5或seq id no.6所示。
6、在本专利技术一些实施例中，所述免疫刺激分子配体与t细胞或nk细胞的免疫刺激分子配合，产生活化t细胞或nk细胞的第一信号的分子，可选的，为cd3抗体、il-15-fc融合蛋白或il-21-fc融合蛋白中的一种或几种。
7、在本专利技术一些实施例中，所述共刺激分子配体是与t细胞或nk细胞的共刺激分子配合，产生活化t细胞或nk细胞的第二信号的分子，所述共刺激分子配体为天然共刺激分子配体或嵌合共刺激分子配体，所述嵌合共刺激分子配体由天然共刺激分子配体的胞外结构域、ii型跨膜蛋白和胞内结构域融合而成，所述天然共刺激分子配体，可选的，为cd137l、ox40l、cd83、cd86中的一种。
8、在本专利技术一些实施例中，所述嵌合共刺激分子为cd70-cd137l融合蛋白、cd94-cd137l融合蛋白、cd69-cd137l融合蛋白、cd30l-cd137l融合蛋白中的一种，所述cd70-cd137l融合蛋白的氨基酸序列如seq id no.7或seq id no.8所示，所述cd94-cd137l融合蛋白的氨基酸序列如seq id no.9或seq id no.10所示，所述cd69-cd137l融合蛋白的氨基酸序列如seq id no.11或seq id no.12所示，所述cd30l-cd137l融合蛋白的氨基酸序列如seq id no.13或seq id no.14所示。
9、一种重组慢病毒载体，所述重组慢病毒载体用于制备所述的可诱发自崩解型人工抗原呈递细胞，所述重组慢病毒载体包含编码fc受体融合蛋白的核酸或编码共刺激分子配体的核酸，所述编码fc受体融合蛋白的核酸，其氨基酸序列为seq id no.1~4中的一种，所述编码共刺激分子配体的核酸，其氨基酸序列为seq id no.7~14中的一种。
10、一种制备以上任一所述的可诱发自崩解型人工抗原呈递细胞的制备方法，包括将所述的重组慢病毒载体在宿主细胞内包装获得慢病毒并使所述慢病毒感染k562细胞的步骤。
11、在本专利技术一些实施例中，所述的可诱发自崩解型人工抗原呈递细胞的制备方法还包括利用抗生素和流式细胞仪筛选的步骤。本文档来自技高网...
【技术保护点】
1. 一种可诱发自崩解型人工抗原呈递细胞，其特征在于，所述可诱发自崩解型人工抗原呈递细胞为表达Fc受体融合蛋白和共刺激分子配体的人工抗原呈递细胞，所述Fc受体融合蛋白具体为CD64-CD7、CD64-CD95或CD64-CD169融合蛋白，所述CD64-CD7融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示，所述CD64-CD95融合蛋白的氨基酸序列如SEQID NO.3或SEQ ID NO.4所示，所述CD64-CD169融合蛋白如SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.6所示。
2.根据权利要求1所述的可诱发自崩解型人工抗原呈递细胞，其特征在于，所述共刺激分子配体为天然共刺激分子配体或嵌合共刺激分子配体，所述嵌合共刺激分子配体由天然共刺激分子配体的胞外结构域、II型跨膜蛋白和胞内结构域融合而成，所述天然共刺激分子配体选自CD137L、OX40L、CD83、CD86中的一种。
3.根据权利要求2所述的可诱发自崩解型人工抗原呈递细胞，其特征在于，所述嵌合共刺激分子配体为CD70-CD137L、CD94-CD137L、CD69-C
4. 一种重组慢病毒载体，其特征在于，所述重组慢病毒载体包含编码Fc受体融合蛋白的核酸或编码共刺激分子配体的核酸，所述编码Fc受体融合蛋白的核酸，其氨基酸序列为SEQ ID NO.1~6中的一种，所述编码共刺激分子配体的核酸，其氨基酸序列为SEQ ID NO.7~14中的一种。
5.一种制备权利要求1~3任一所述的可诱发自崩解型人工抗原呈递细胞的制备方法，其特征在于，所述方法包括将权利要求4所述的重组慢病毒载体在宿主细胞内包装获得慢病毒并使所述慢病毒感染K562细胞的步骤。
6.权利要求1-3任一所述的可诱发自崩解型人工抗原呈递细胞作为免疫细胞的饲养细胞的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述免疫细胞为T细胞，所述应用包括将T细胞与可诱发自崩解型人工抗原呈递细胞共培养，并加入CD3抗体的步骤，所述可诱发自崩解型人工抗原呈递细胞经过或不经过辐照。
8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述免疫细胞为NK细胞，所述应用包括将NK细胞与可诱发自崩解型人工抗原呈递细胞共培养，并加入IL-15的Fc融合蛋白、IL-21的Fc融合蛋白、IL-2的Fc融合蛋白、CD3抗体的步骤，所述可诱发自崩解型人工抗原呈递细胞经过或不经过辐照。
...【技术特征摘要】
1. 一种可诱发自崩解型人工抗原呈递细胞，其特征在于，所述可诱发自崩解型人工抗原呈递细胞为表达fc受体融合蛋白和共刺激分子配体的人工抗原呈递细胞，所述fc受体融合蛋白具体为cd64-cd7、cd64-cd95或cd64-cd169融合蛋白，所述cd64-cd7融合蛋白的氨基酸序列如seq id no.1或seq id no.2所示，所述cd64-cd95融合蛋白的氨基酸序列如seqid no.3或seq id no.4所示，所述cd64-cd169融合蛋白如seq id no.5或seq id no.6所示。
2.根据权利要求1所述的可诱发自崩解型人工抗原呈递细胞，其特征在于，所述共刺激分子配体为天然共刺激分子配体或嵌合共刺激分子配体，所述嵌合共刺激分子配体由天然共刺激分子配体的胞外结构域、ii型跨膜蛋白和胞内结构域融合而成，所述天然共刺激分子配体选自cd137l、ox40l、cd83、cd86中的一种。
3.根据权利要求2所述的可诱发自崩解型人工抗原呈递细胞，其特征在于，所述嵌合共刺激分子配体为cd70-cd137l、cd94-cd137l、cd69-cd137l、cd30l-cd137l融合蛋白中的一种，所述cd70-cd137l融合蛋白的氨基酸序列如seq id no.7或seq id no.8所示，所述cd94-cd137l融合蛋白的氨基酸序列如seq id no.9或seq id no.10所示，所述cd69-cd137l融合蛋白的氨...
【专利技术属性】
技术研发人员：熊锴，苏梅，秦引林，史央，陈冠良，
申请(专利权)人：江苏柯菲平医药股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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