【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于动物模型构建，尤其涉及构建apod条件敲入小鼠模型的方法。
技术介绍
1、载脂蛋白d (apolipoprotein d，apo d)是一个分子量约为33kda的糖蛋白，在人类中由apod基因编码。它最初是在人血浆的高密度脂蛋白中被分离出来的，不同于其他主要在肝脏中产生的脂蛋白，apo d主要产生于大脑和睾丸。apo d在结构上与其他类型的载脂蛋白存在很大的差异，被归入脂肪促成素家族。
2、apo d可以与胆固醇、黄体酮、胆红素等多种疏水性小分子结合。另外，apo d在多种脊索动物的各类组织中广泛表达，揭示了apo d在脊椎动物中重要的生理功能。最近的研究表明，apo d可以作为多种癌症及神经系统疾病的早期诊断标记，因而备受关注。
3、目前对apo d的研究集中在基因表达、组织分布和具体功能上。研究apod的小鼠模型主要是常规的基因敲除或过表达，由于这两种方法是全身性调控apod的表达，因此不能准确的研究apod在某一组织的功能。
技术实现思路
1、为解决现有研究apod的小鼠模型不能用于准确的研究apod在某一组织的功能的问题，本专利技术提供了构建apod条件敲入小鼠模型的方法。
2、本专利技术的技术方案：
3、构建apod条件敲入小鼠模型的方法，通过crispr/cas9技术在小鼠的rosa26基因位点定点敲入cag-lsl-apod-wpre-pa表达框；具体包括如下步骤：
4、步骤一、通过体外转录的方
5、步骤二、通过in-fusion cloning的方法构建同源重组载体；
6、步骤三、将步骤一所得cas9 mrna、grna和步骤二所得同源重组载体共同注射到c57bl/6j小鼠受精卵中，获得f0代小鼠；
7、步骤四、对f0代小鼠进行基因型鉴定，将阳性f0代小鼠与c57bl/6j小鼠交配得到f1代小鼠，对f1代小鼠进行基因型鉴定，阳性f1代小鼠即为所述小鼠模型。
8、进一步的，步骤一所述grna的核苷酸序列如seq id no.1所示。
9、进一步的，步骤一所述cas9 mrna的核苷酸序列如seq id no.2所示。
10、进一步的，步骤二所述同源重组载体包括5’同源臂、cag-lsl-apod-wpre-pa和3’同源臂；所述5’同源臂的核苷酸序列如seq id no.3所示，所述cag-lsl-apod-wpre-pa的核苷酸序列如seq id no.4所示，所述3’同源臂的核苷酸序列如seq id no.5所示。
11、进一步的，步骤三所述注射到c57bl/6j小鼠受精卵的注射剂量为10 pl，培养基为ksom，培养条件为37℃，5%co2。
12、进一步的，步骤四所述对f0代小鼠和f1代小鼠进行基因型鉴定的方法是用pcr检测同源臂，所述pcr检测的引物为核苷酸序列如seq id no.6所示的引物1和核苷酸序列如seq id no.7所示的引物2，pcr扩增得到3.6kb片段表示5’同源臂含有阳性基因组，pcr扩增得到5.2kb片段表示5’同源臂含有阴性基因组。
13、进一步的，步骤四所述对f0代小鼠和f1代小鼠进行基因型鉴定的方法是用pcr检测同源臂，所述pcr检测的引物为核苷酸序列如seq id no.8所示的引物3和核苷酸序列如seq id no.9所示的引物4，pcr扩增得到3.6kb片段表示3’同源臂含有阳性基因组，pcr扩增得到6.5kb片段表示3’同源臂含有阴性基因组。
14、进一步的，对所述小鼠模型的基因型进行鉴定采用pcr扩增的方法，pcr扩增所用引物对包括核苷酸序列如seq id no.10所示的引物5和核苷酸序列如seq id no.11所示的引物6，以及核苷酸序列如seq id no.12所示的引物7和核苷酸序列如seq id no.13所示的引物8；pcr扩增得到的野生型基因片段大小为967bp，纯合子基因片段大小为346bp。
15、本专利技术的有益效果：
16、本专利技术提供的构建apod条件敲入小鼠模型的方法，采用crispr/cas9技术，通过同源重组的方法在小鼠的rosa26基因位点定点敲入cag-lsl-apod-wpre-pa表达框，实现了高效率基因敲入，构建了能够稳定表达apod基因的小鼠模型。将其用于研究apod在某一组织中的功能时，可以准确调控apod的表达，提高了apod功能研究结果的可靠性。
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1.构建APOD条件敲入小鼠模型的方法，其特征在于，通过CRISPR/Cas9技术在小鼠的Rosa26基因位点定点敲入CAG-LSL-Apod-Wpre-pA表达框；具体包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述构建APOD条件敲入小鼠模型的方法，其特征在于，步骤一所述gRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
3.根据权利要求1或2所述构建APOD条件敲入小鼠模型的方法，其特征在于，步骤一所述Cas9 mRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
4.根据权利要求3所述构建APOD条件敲入小鼠模型的方法，其特征在于，步骤二所述同源重组载体包括5’同源臂、CAG-LSL-Apod-Wpre-pA和3’同源臂；所述5’同源臂的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述CAG-LSL-Apod-Wpre-pA的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述3’同源臂的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
5.根据权利要求4所述构建APOD条件敲入小鼠模型的方法，其特征在于，步骤三所述注射到C57BL/6J小鼠受精卵的注射剂
6.根据权利要求5所述构建APOD条件敲入小鼠模型的方法，其特征在于，步骤四所述对F0代小鼠和F1代小鼠进行基因型鉴定的方法是用PCR检测同源臂，所述PCR检测的引物为核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示的引物1和核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示的引物2，PCR扩增得到3.6kb片段表示5’同源臂含有阳性基因组，PCR扩增得到5.2kb片段表示5’同源臂不含有阳性基因组。
7.根据权利要求5所述构建APOD条件敲入小鼠模型的方法，其特征在于，步骤四所述对F0代小鼠和F1代小鼠进行基因型鉴定的方法是用PCR检测同源臂，所述PCR检测的引物为核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示的引物3和核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示的引物4，PCR扩增得到3.6kb片段表示3’同源臂含有阳性基因组，PCR扩增得到6.5kb片段表示3’同源臂不含有阳性基因组。
8.根据权利要求5所述构建APOD条件敲入小鼠模型的方法，其特征在于，对所述小鼠模型的基因型进行鉴定采用PCR扩增的方法，PCR扩增所用引物对包括核苷酸序列如SEQ IDNO.10所示的引物5和核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示的引物6，以及核苷酸序列如SEQ IDNO.12所示的引物7和核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示的引物8；PCR扩增得到的野生型基因片段大小为967bp，阳性基因片段大小为346bp。
...【技术特征摘要】
1.构建apod条件敲入小鼠模型的方法，其特征在于，通过crispr/cas9技术在小鼠的rosa26基因位点定点敲入cag-lsl-apod-wpre-pa表达框；具体包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述构建apod条件敲入小鼠模型的方法，其特征在于，步骤一所述grna的核苷酸序列如seq id no.1所示。
3.根据权利要求1或2所述构建apod条件敲入小鼠模型的方法，其特征在于，步骤一所述cas9 mrna的核苷酸序列如seq id no.2所示。
4.根据权利要求3所述构建apod条件敲入小鼠模型的方法，其特征在于，步骤二所述同源重组载体包括5’同源臂、cag-lsl-apod-wpre-pa和3’同源臂；所述5’同源臂的核苷酸序列如seq id no.3所示，所述cag-lsl-apod-wpre-pa的核苷酸序列如seq id no.4所示，所述3’同源臂的核苷酸序列如seq id no.5所示。
5.根据权利要求4所述构建apod条件敲入小鼠模型的方法，其特征在于，步骤三所述注射到c57bl/6j小鼠受精卵的注射剂量为10 pl，培养基为ksom，培养条件为37℃，5%co2。
6.根据权利要求5所述构建apod条件敲入小鼠模型的方法，其特征在于，步...
【专利技术属性】
技术研发人员：董洋，
申请(专利权)人：深圳华瑞模式生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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