【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于蔬菜作物遗传育种，涉及一种芦笋超雄株的快速鉴定与繁殖方法。
技术介绍
1、芦笋(asparagus officinalis l.)，是百合科天门冬属的多年生草本植物，又称龙须菜、石刁柏，以新生嫩茎为食用部位，其嫩茎脆嫩爽口，营养丰富，被誉为“世界十大名菜之一”。芦笋富含蛋白质、矿物质、维生素、多糖、黄酮类物质以及人体所需要的多种氨基酸等营养成分，具有促消化、抗肿瘤、抗衰老、降血糖等保健功能，食疗价值高(孙春艳，等.芦笋的化学成分及药理作用研究进展.中国野生植物资源，2004(05)：1-5)。
2、芦笋属于雌雄异株植物，通过种子繁殖，自然群体内遗传复杂，品种退化严重、繁育速度缓慢。目前我国芦笋优良品种种子主要依赖于国外进口，育种方面缺乏先进的繁育技术和创新品种。芦笋的性别为异型xy型决定方式，由位于性染色体(l5)上的一对等位基因m和m控制。开两性花的雄性基因型可被称作雄全株。两性花自交可以产生25％的“超雄株”(mm)，“超雄株”和雌性基因型(mm)之间杂交可产生f1代全为雄性杂合基因型(mm)的全雄品系。雄株不结籽，大量碳水化合物向下运输储存于鳞茎盘中，萌发的新笋直径比雌株大，所以产量一般比雌株高20～25％，且雄株在长势、寿命、抗病抗逆性等方面均优于雌株。全雄育种是芦笋育种工作的重要方向之一。通过传统的形态观察法鉴定自交后代性别受芦笋开花时期限制。因此，结合分子标记辅助育种对自交后代苗期进行性别鉴定，可帮助杂交制种亲本选择，加快育种速度，为芦笋全雄育种奠定基础。近年来，研究人员陆续开发与芦笋性别相
3、组织培养是通过无菌操作，将外植体接种于培养基上，在人工控制的营养和环境条件下进行培养，使其在较短的时间内快速再生出大量完整植株的方法。前人研究表明在相同的培养条件下，芦笋离体再生受基因型影响很大(孔萌萌，等.芦笋组织培养生根技术.上海师范大学学报(自然科学版)，2006(02)：91-94.)，目前国内通过器官发生途径先诱导外植体分化愈伤组织，再诱导不定芽和不定根，高效形成完整植株的研究鲜有报道。因此，建立芦笋愈伤组织诱导及其高效再生体系，可快速获得大量超雄株，为芦笋全雄育种工作提供大量重要种质材料，同时为芦笋遗传转化体系建立提供技术支撑。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供一种芦笋超雄株的快速鉴定与繁殖方法，以解决芦笋全雄育种年限长、现有性别分子标记品种适应性差、准确性较低、超雄亲本材料紧缺等产业实际问题。
2、本专利技术提供的技术方案是：一种芦笋超雄株的快速鉴定与繁殖方法，包括以下步骤：
3、步骤1、基因组dna提取：取不同性别类型的芦笋植株材料幼叶或嫩芽，采用改良的ctab法提取基因组dna；
4、步骤2、pcr扩增：以芦笋基因组dna为模板、使用共显性标记引物进行pcr扩增。pcr反应体系为10μl，即2×rapid taq master mix(vazyme biotech co.，ltd)5μl，ddh2o 3μl，引物f/r(10μm)各0.5μl，dna模板(20ng/μl)1μl。pcr扩增反应程序为：94℃预变性3min；95℃变性45s，55℃退火45s，72℃延伸40s，30个循环；72℃延伸5min；10℃保存。其中所述共显性标记asp-yy01的正向引物和反向引物序列如下：
5、asp-yy01f：5’-ggtatggagcttacattgatgca-3’
6、asp-yy01r：5’-ctagtgcatataggctgtgatgt-3’
7、asp-yy01引物对在超雄株中的扩增序列是长度为226bp的条带，具体序列如下：
8、
9、步骤3、凝胶电泳：利用6％聚丙烯酰氨凝胶(page)电泳进行pcr产物检测，凝胶清晰显影后拍照保存。具体操作步骤如下：
10、(1)制胶。将电泳玻璃板洗净、晾干，于玻璃板左右两侧放置胶条，边框处夹紧夹子，插入梳子调试松紧。配制acr：bis(29：1)凝胶混合液缓慢倒入胶板内，插入梳子，待凝胶混合液凝固备用。
11、(2)预电泳。取下夹子和胶条，将胶板安装进电泳槽内，在上下电泳槽内倒入1×tbe缓冲液，拔出梳子，90v电压下预电泳10min。
12、(3)电泳。点样1.2μl，120v恒压下电泳1.5h。
13、(4)固定与银染。拆下胶块平放于由纯水、冰乙酸、乙醇和硝酸银配制的固定银染液里，置于摇床上避光轻晃15min。
14、(5)显影。将固定银染液倒掉，清水清洗两次。倒入由纯水、甲醛和氢氧化钠配制的显色液中，放置在摇床上轻晃，至条带清晰为止。相机拍照保存。
15、步骤4、结果分析：普通雄株扩增出226bp和200bp两条条带，超雄株扩增出较长的一条条带(226bp)，雌株扩增出较短的一条条带(200bp)，性别检测结果应与田间花形态一致。
16、步骤5、外植体预处理：选取上述分子标记鉴定到的芦笋超雄株新生嫩茎作为外植体，用自来水冲洗5～10mim，然后剥去嫩茎上的鳞片，用超纯水冲洗干净后放入灭菌瓶；置于超净台用75％酒精浸泡35s，无菌水冲洗一遍，然后用0.5％次氯酸钠浸泡12～15min，最后无菌水冲洗3～4次，于无菌滤纸上晾干备用。
17、步骤6、愈伤组织诱导：用解剖刀将晾干后的嫩茎切成0.5～1.0cm长的茎段并纵剖成两半，接种于愈伤组织诱导培养基：ms+1.0mg/l 6-ba+0.75mg/l naa，30g/l蔗糖，8.0g/l琼脂，调节ph值5.8～6.0；接种后于温度25℃，光照16h/d，光照强度为20000lux的恒温培养室培养，进行初生愈伤组织诱导。培养25～30d后将外植体表面初生愈伤组织切下置于相同组分培养基上继代增殖2～3次，获得具有分化能力的愈伤组织。
18、步骤7、不定芽诱导：将上述生长状态良好的愈伤组织接种于愈伤分化培养基：ms+2.0mg/l 6-ba+0.05mg/l naa，30g/l蔗糖，8.0g/l琼脂，调节ph值为5.8～6.0；接种后于温度25℃，光照16h/d，光照强度为20000lux的恒温培养室培养，诱导愈伤组织产生芽点，进而分化出不定芽。
19、步骤8、不定根诱导：切取生长健壮的芽苗茎尖竖直接种于生根培养基：1/2ms+1.0mg/l iba+0.02mg/l kt+0.5g/l ac，30g/l蔗糖，8.0g/l琼脂，ph5.8～6.0；接种后于温度25℃，光照16h/d，光照强度为20000lux的恒温培养室培养，诱导不定根形成。接种后15～20d茎基部形成根原基，根系逐渐伸长变粗，40d左右形成完整的再生植株。
20、步骤9、炼苗移栽：待新生植株根系发达、茎叶本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种芦笋超雄株的快速鉴定与繁殖方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.如权利要求1所述的芦笋超雄株的快速鉴定与繁殖方法，其特征在于，步骤2PCR扩增，所述共显性标记Asp-YY01包括如下引物对：
3.如权利要求1所述的芦笋超雄株的快速鉴定与繁殖方法，其特征在于，步骤2 PCR扩增中，扩增时采用的反应体系为10μL，即2×Rapid Taq Master Mix(Vazyme Biotech Co.，Ltd)5μL，ddH2O 3μL，引物F/R(10μM)各0.5μL，DNA模板(20ng/μL)1μL。PCR扩增反应程序为：94℃预变性3min；95℃变性45s，55℃退火45s，72℃延伸40s，30个循环；72℃延伸5min；10℃保存。
4.如权利要求1所述的芦笋超雄株的快速鉴定与繁殖方法，其特征在于，步骤5外植体预处理中，先将芦笋嫩茎用自来水冲洗5～10min，然后剥去嫩茎上的鳞片，用超纯水冲洗干净后放入灭菌瓶；置于超净台用75％酒精浸泡35s，无菌水冲洗一遍，然后用0.5％次氯酸钠浸泡12～15min，最后用无菌水冲洗3～4次，
5.如权利要求1所述的芦笋超雄株的快速鉴定与繁殖方法，其特征在于，步骤6愈伤组织诱导中，茎段晾干后接种至愈伤组织诱导培养基：MS+1.0mg/L 6-BA+0.75mg/L NAA，30g/L蔗糖，8.0g/L琼脂，调节pH值5.8～6.0；接种后于温度25℃，光照16h/d，光照强度为20000lux的恒温培养室培养。
6.如权利要求1所述的芦笋超雄株的快速鉴定与繁殖方法，其特征在于，步骤7不定芽诱导中，将生长状态良好的愈伤组织接种于愈伤组织分化培养基：MS+2.0mg/L 6-BA+0.05mg/L NAA，30g/L蔗糖，8.0g/L琼脂，pH值5.8～6.0；接种后于温度25℃，光照16h/d，光照强度为20000lux的恒温培养室培养。
7.如权利要求1所述的芦笋超雄株的快速鉴定与繁殖方法，其特征在于，步骤8不定根诱导中，不定根诱导培养基为：1/2MS+1.0mg/L IBA+0.02mg/L KT+0.5g/L AC，30g/L蔗糖，8.0g/L琼脂，pH值5.8～6.0；接种后于温度25℃，光照16h/d，光照强度为20000lux的恒温培养室培养。
8.如权利要求1所述的芦笋超雄株的快速鉴定与繁殖方法，其特征在于，步骤9炼苗移栽中，所述基质由草炭、蛭石、土构成，比例为3∶1∶1。
...【技术特征摘要】
1.一种芦笋超雄株的快速鉴定与繁殖方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.如权利要求1所述的芦笋超雄株的快速鉴定与繁殖方法，其特征在于，步骤2pcr扩增，所述共显性标记asp-yy01包括如下引物对：
3.如权利要求1所述的芦笋超雄株的快速鉴定与繁殖方法，其特征在于，步骤2 pcr扩增中，扩增时采用的反应体系为10μl，即2×rapid taq master mix(vazyme biotech co.，ltd)5μl，ddh2o 3μl，引物f/r(10μm)各0.5μl，dna模板(20ng/μl)1μl。pcr扩增反应程序为：94℃预变性3min；95℃变性45s，55℃退火45s，72℃延伸40s，30个循环；72℃延伸5min；10℃保存。
4.如权利要求1所述的芦笋超雄株的快速鉴定与繁殖方法，其特征在于，步骤5外植体预处理中，先将芦笋嫩茎用自来水冲洗5～10min，然后剥去嫩茎上的鳞片，用超纯水冲洗干净后放入灭菌瓶；置于超净台用75％酒精浸泡35s，无菌水冲洗一遍，然后用0.5％次氯酸钠浸泡12～15min，最后用无菌水冲洗3～4次，于无菌滤纸上晾干备用。
5.如权利要求1所述的芦笋超雄株的快速鉴定与繁殖方法，其特征...
【专利技术属性】
技术研发人员：柳李旺，赵福素，崔峰，徐良，王燕，赵博雅，刘宝阳，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：
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