【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因工程，具体涉及一种microrna定量检测的内参及其制备方法和应用。
技术介绍
1、肺癌是世界上发病率和死亡率最高的恶性肿瘤，严重危害人类健康。肺癌早期病情隐匿，通常没有明显症状，大多数患者被诊断时已为中晚期，且预后不佳，五年生存率约为5-15％。然而，对于早期阶段(i-ii期)接受手术切除的患者，五年生存率可达65-85％。因此，除了一级预防(如控制吸烟)，提高早期诊断效率对肺癌患者获得良好预后非常重要。目前，肺癌的早期诊断方法有胸部影像学、支气管镜检技术和痰液细胞学检查等，但这些方法的检测效果均不理想，需要改进。例如，广泛应用的低剂量螺旋ct(ldct)存在辐射暴露、高假阳性率和过度诊断等问题，同时血清肿瘤抗原标记物对肺癌的敏感性或特异性较差，限制了其临床应用。因此，寻找特异性和敏感性高的肺癌早期诊断标志物成为目前的研究热点。
2、小胞外囊泡(smallextracellular vesicles,sevs)，又称外泌体，作为一种有前途的疾病循环生物标志物，在癌症的早期诊断、预后监测和免疫治疗等领域的作用已得到广泛关注和深入研究。外泌体是由多种细胞类型在体内和体外主动分泌的直径约30-150nm的膜性囊泡，可在所有生物体液中发现，内容物含有蛋白质、脂质和核酸(如microrna、mrna、lncrna和circrna)等生物活性分子，可以反映细胞起源和生理状态。研究表明，肺癌细胞比正常组织细胞分泌更多的外泌体到血液中(pmid:19289371)，从肺癌患者的外泌体中提取的microrna(mi
3、反转录实时定量pcr技术是检测mirna表达水平的最常用而有效的方法，具有快速、经济、易用等优点。然而不同样本之间存在rna提取质量、逆转录效率、pcr扩增效率以及实验操作误差等方面的差异，此会对目的基因表达结果的可靠性产生影响。采用一个或多个内源性分子作为检测目的基因表达的内参分子，不仅可以有效控制操作差异，还可以控制个体自身的生物学差异。然而外泌体mirna检测至今还没有一个公认的内参分子，以往研究者主要根据参考文献或自身经验选用内参，如最常被用作内参分子的u6仅在细胞核中表达，检测到u6的表达很可能是由于外泌体分离方法纯度不够导致的，另外一些常被用作内参的mir-16和mir-451等又极易受到溶血干扰，还有一些潜在的可用作外泌体mirna内参的分子在不同生理-病理状态下表达并不稳定，盲目使用未经验证的内参分子可能导致错误甚至相反的结论。外参法作为外泌体mirna定量分析的另一种可选策略，主要还是校正质控rna提取、逆转录以及qpcr过程，无法质控前期最为复杂的外泌体分离过程，也不能完全满足外泌体定量研究的需求。
4、目前，血浆小胞外囊泡mirna定量检测中存在的难以校正和标准化的问题，不仅导致测序数据与qpcr结果吻合度较差，降低发现生物标志物的可能性，同时也限制了外泌体mirna生物标志物的相关研究成果的临床转化。
5、中国专利申请cn109536502a中基于少量样本(包括10例mtx敏感病人和10例mtx耐药病人)发现在妊娠滋养细胞肿瘤患者血浆外泌体mirna中稳定表达的内参分子，以此作为候选内参分子在另一组独立队列中进行验证，从而公开一种适用于妊娠滋养细胞肿瘤患者血浆外泌体mirna qrt-pcr定量检测的新内参分子mir-129-5p。但是该研究所涉及的发现队列样本数量过少，分析结果很难代表整个妊娠滋养细胞肿瘤患者群体，而且该研究发现的内参分子mir-129-5p也不能直接用于肺癌患者血浆小胞外囊泡mirna qrt-pcr的检测分析。
6、论文pmid:33429910中，研究人员通过分析公共血浆外泌体rna-seq数据，确定并选择了一组丰度稳定的mirnas作为候选标准化分子，随后采用qrt-pcr检测了健康对照和四种具有代表性的儿童淋巴瘤患者血浆外泌体中候选mirnas的丰度变化，从而提出mir-26a-5p可用于儿童血液系统恶性肿瘤患者血浆外泌体mirna qrt-pcr标准化。然而mir-26a-5p不能直接用于肺癌患者血浆小胞外囊泡mirna qrt-pcr定量检测。
7、目前有关肺癌患者血浆小胞外囊泡mirna qrt-pcr检测内参分子的研究尚未见报道。
技术实现思路
1、本专利技术旨在发现并公开一种microrna定量检测的内参及其制备方法和应用，其目的在于提供一种适用于肺癌患者血浆小胞外囊泡mirna qrt-pcr检测的内参分子，以期用于校正不同样本之间实验过程中的误差，更好的对定量数据进行校正和标准化，提高血浆小胞外囊泡mirna作为肺癌早期诊断或治疗生物标志物的准确性和可靠性。
2、本专利技术的技术方案是这样实现的：
3、本专利技术提供一种microrna定量检测的内参，其特征在于，所述内参选自mir-140-3p、mir-425-5p、mir-21-5p、mir-425-3p、mir-22-3p、let-7g-5p、mir-30e-5p、let-7i-5p、mir-181b-5p和mir-345-5p中任一种或其组合；所述mir-140-3p的核苷酸序列如seq idno.1所示；所述mir-425-5p的核苷酸序列如seq id no.2所示；所述mir-21-5p的核苷酸序列如seq id no.3所示；所述mir-425-3p的核苷酸序列如seq id no.4所示；所述mir-22-3p的核苷酸序列如seq id no.5所示；所述let-7g-5p的核苷酸序列如seq id no.6所示；所述mir-30e-5p的核苷酸序列如seq id no.7所示；所述let-7i-5p的核苷酸序列如seq idno.9所示；所述mir-181b-5p的核苷酸序列如seq id no.9所示；所述mir-345-5p的核苷酸序列如seq id no.10所示。
4、作为本专利技术的进一步改进，所述microrna定量检测的内参选自mir-140-3p、mir-425-3p、mir-425-5p和mir-21-5p中任一种或其组合。
5、作为本专利技术的进一步改进，所述microrna定量检测的内参为mir-140-3p。
6、本专利技术进一步保护一种上述的microrna定量检测的内参用于制备肺结节的诊断或治疗生物标志物中的应用。
7、本专利技术进一步保护上述内参基因在制备用于肺结节的microrna定量检测试剂盒或用于诊断肺结节的试剂盒中的应用。
8、本专利技术进一步保护一种上述的microrna定量检测的内参的制备方法包括以下步骤：
9、s1.对血浆样本进行血浆小胞外囊泡的提取；
10、s2.对提取得到的血浆小胞外囊泡进行mirna的抽提及表达检测；...
【技术保护点】
1.一种microRNA定量检测的内参，其特征在于，所述内参选自miR-140-3p、miR-425-5p、miR-21-5p、miR-425-3p、miR-22-3p、let-7g-5p、miR-30e-5p、let-7i-5p、miR-181b-5p和miR-345-5p中任一种或其组合；所述miR-140-3p的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述miR-425-5p的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述miR-21-5p的核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示；所述miR-425-3p的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述miR-22-3p的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；所述let-7g-5p的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；所述miR-30e-5p的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；所述let-7i-5p的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；所述miR-181b-5p的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；所述miR-345-5p的核苷酸序列如SEQ IDNO.10所示。
2.根据权利要求1所述microR
3.根据权利要求2所述microRNA定量检测的内参，其特征在于，所述microRNA定量检测的内参为miR-140-3p。
4.一种如权利要求1-3任一项所述的microRNA定量检测的内参用于制备肺结节的诊断或治疗生物标志物中的应用。
5.一种如权利要求1-3任一项所述的microRNA定量检测的内参的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤S1中所述血浆小胞外囊泡的提取的方法包括：试剂提取法、超速离心提取法、梯度密度离心提取法、超滤离心提取法、磁珠免疫提取法中的至少一种。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述血浆样品为健康人和良恶性肺结节患者血浆样品。
8.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤S2中所述血浆小胞外囊泡miRNA抽提的具体方法如下：使用miRNeasy Serum/Plasma Kit试剂盒进行血浆小胞外囊泡miRNA的提取。
9.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤S4中所述miRNA候选内参分子的选择的具体方法如下：
10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S4具体包括：
11.根据权利要求10所述的制备方法，其特征在于，所述N的取值为60，所述M的取值为6-10。
12.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，所述待验证的候选内参包括miR-140-3p、miR-425-5p、miR-21-5p、miR-425-3p、miR-22-3p、let-7g-5p、miR-30e-5p、let-7i-5p、miR-181b-5p和miR-345-5p。
13.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤S6所述对待验证的候选内参进行稳定性验证的方法包括：
14.一种检测试剂，其特征在于，包括如权利要求1-3任一项所述的microRNA定量检测的内参。
15.一种检测试剂盒，其特征在于，包括如权利要求14所述的检测试剂。
16.一种如权利要求14所述的检测试剂盒在肺结节的microRNA定量检测中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种microrna定量检测的内参，其特征在于，所述内参选自mir-140-3p、mir-425-5p、mir-21-5p、mir-425-3p、mir-22-3p、let-7g-5p、mir-30e-5p、let-7i-5p、mir-181b-5p和mir-345-5p中任一种或其组合；所述mir-140-3p的核苷酸序列如seq id no.1所示；所述mir-425-5p的核苷酸序列如seq id no.2所示；所述mir-21-5p的核苷酸序列如seq idno.3所示；所述mir-425-3p的核苷酸序列如seq id no.4所示；所述mir-22-3p的核苷酸序列如seq id no.5所示；所述let-7g-5p的核苷酸序列如seq id no.6所示；所述mir-30e-5p的核苷酸序列如seq id no.7所示；所述let-7i-5p的核苷酸序列如seq id no.9所示；所述mir-181b-5p的核苷酸序列如seq id no.9所示；所述mir-345-5p的核苷酸序列如seq idno.10所示。
2.根据权利要求1所述microrna定量检测的内参，其特征在于，所述microrna定量检测的内参选自mir-140-3p、mir-425-3p、mir-425-5p和mir-21-5p中任一种或其组合。
3.根据权利要求2所述microrna定量检测的内参，其特征在于，所述microrna定量检测的内参为mir-140-3p。
4.一种如权利要求1-3任一项所述的microrna定量检测的内参用于制备肺结节的诊断或治疗生物标志物中的应用。
5.一种如权利要求1-3任一项所述的microrna定量检测的内参的制备方法，其特征在于，包括以下步...
【专利技术属性】
技术研发人员：李志宽，张大东，陈升，许晓雅，年宝宁，
申请(专利权)人：上海思路迪生物医学科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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