【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于干细胞生物学领域，涉及人诱导多能干细胞的谱系特异性分化，具体涉及一种间充质干细胞及其制备方法与应用。
技术介绍
1、骨关节炎（osteoarthritis，oa）是一种以关节软骨退化、滑膜炎、软骨下骨硬化和骨赘形成为特征的慢性退行性疾病。世界范围内，有15%的人口患有oa；伴随着老龄化和肥胖化的发生，65岁以上人群中有80%会罹患oa；由于关节软骨无血管、无神经和无淋巴，一旦发生oa，很难自行愈合，通常带来严重的疼痛感和活动能力限制，继而影响患者的生活质量和加重经济负担。因传统治疗骨关节炎的方法，如药物治疗、物理治疗等仅限于缓解症状（如疼痛管理），而不能有效地解决潜在的疾病过程，包括oa的进展和软骨再生。若oa持续发展，则需要进行关节置换手术。因此，迫切需要新的oa治疗方法来逆转oa的进程并最终治愈oa。为了解决临床上的这一需求，间充质干细胞（mscs）在再生医学领域已成为一种有前景的oa治疗方法。
2、mscs是一种具有多向分化、免疫调节、抗纤维化、抗炎、抗凋亡和促血管生成等生物学特性的成体干细胞，在组织修复、癌症治疗和免疫调控方面发挥重要作用，被广泛用于人类各种疾病的研究和治疗。当前，在进行临床试验阶段的用于治疗oa的mscs可以来源于多种组织，包括骨髓、脂肪和脐带组织等。其中，骨髓源mscs（bm-mscs）是当前使用最多的一类mscs，但其可能并不适用于oa的治疗，这是因为它易于形成肥大型软骨细胞（可能是他们软骨内骨形成程序的一个组成部分）；脂肪源mscs（ad-mscs）因易于获取而受到了广泛
3、因此，为了实现mscs在临床上的应用，迫切需要解决mscs的来源问题。除了在体提取（成体）mscs外，使用多能干细胞（pscs）诱导分化获得i-mscs也是mscs的重要来源。mscs的体内细胞发育来源为当前将pscs诱导分化成mscs提供了很好的参照依据。虽然当前mscs的发育起源尚不完全清楚，但在体内，中胚层和神经嵴被认为是mscs的主要发育来源。为此，大量的研究仿生这些发育途径，在体外将pscs经中胚层细胞系或神经嵴细胞系逐步诱导分化得到mscs。其中，经过神经嵴细胞系得到mscs因获得的神经嵴细胞系具有自我更新能力和多潜能性（表型稳定），且最终能快速诱导分化得到mscs，且所获得的mscs成软骨分化能力强，更易得到透明软骨表型的软骨细胞，而受到了oa患者的青睐。
4、当前，基于神经嵴细胞系诱导pscs分化得到mscs过程的研究主要涉及到关键的两步诱导培养，包括pscs诱导分化成nccs和nccs诱导分化成mscs。其中，psc诱导分化成nccs细胞系的过程主要涉及到smad信号通路（抑制）和wnt信号通路（激活）的调控，通过当前的调控策略获得的nccs往往纯度不高，需要经过流式细胞仪进行分选。为此，亟需优化的方案解决获得高纯度nccs的问题。
5、综上所述，虽然很多研究者已经研发出不少从hpscs在体外分化成mscs的方法，但现有的方法仍然不够成熟，比如需要使用血清等非特异性、随机性的诱导成间充质干细胞，需要使用流式等技术筛选才能获得高纯度的细胞，因而分化效果不稳定、效率低、且时间长等问题；另外经由中胚层细胞系分化路径获得的mscs由于中胚层细胞系不易于存储，使得细胞最终产率较低，而经由神经嵴细胞系路径获得的mscs由于神经嵴细胞自身的可扩增性和可储存性使得整个细胞生产过程可获得大量的二级细胞存储。
技术实现思路
1、为了解决现有技术的缺陷，本专利技术第一个方面提供了一种用于骨关节炎药物的间充质干细胞构建方法，包含如下步骤：
2、s1：人多能干细胞诱导形成神经嵴细胞；制备硬基底，使得基底刚度为500-3000kpa，将人多能干细胞的上清液吸除，加入特异性神经嵴细胞诱导培养基培养，向特异性神经嵴细胞诱导培养基中加入信号通路调节剂：bmp抑制剂、gsk-3抑制剂和如下三者之一：activin、nodal和tgfb抑制剂；其中所述人多能干细胞为商业化人胚胎干细胞系或人诱导型多能干细胞；
3、s2：神经嵴细胞扩增培养；制备软基底，使得基底刚度为1-10 kpa将特异性神经嵴细胞诱导分化培养基吸除，使用edta或accutase消化形成的神经嵴细胞，并将细胞重悬于软基底的培养板中，加入神经嵴细胞扩增培养基进行扩增培养7天，并向扩增培养基中添加bfgf、egf和如下三者之一：activin、nodal和tgfb抑制剂；在此期间神经嵴细胞使用冻存液进行冻存；
4、s3：扩增培养后的神经嵴细胞向间充质干细胞分化。
5、优选的，所述s3之后还包括s4：将间充质干细胞扩增培养。
6、优选的，所述s4之后还包括s5：将扩增培养得到的间充质干细胞进行鉴定。
7、优选的，所述步骤s1之前还包括步骤s0：人多能干细胞的培养。
8、优选的，该步骤s1为：培养8-10天，所述信号通路调节剂的浓度依次为：500nm、10μm和3μm；所述信号通路调节剂的加入时间依次为：0-2天、0-3天和3-6天；所述的神经嵴细胞诱导培养基由以下成分组成：dmem/f12培养基、浓度为64mg/l的左旋抗坏血酸、浓度为14μg/l的亚硒酸钠、浓度为10.7mg/l的转铁蛋白、浓度为543mg/l的碳酸氢钠、浓度为19.4mg/l的胰岛素、浓度为100μg/l的成纤维生长因子2、浓度为2μg/l的转录生长因子β-3。
9、优选的，该步骤s2为：
10、所述的activin、nodal或tgfb抑制剂浓度为10μm，bfgf的浓度为8ng/ml，egf的浓度为20ng/ml；所述的神经嵴细胞扩增培养基由以下成分组成: dmem/f12培养基、浓度为64mg/l的左旋抗坏血酸、浓度为14μg/l的亚硒酸钠、浓度为10.7mg/l的转铁蛋白、浓度为543mg/l的碳酸氢钠、浓度为19.4mg/l的胰岛素、浓度为100μg/l的成纤维生长因子2、浓度为2μg/l的转录生长因子β-3；所述的冻存液主要成分为二甲基亚砜和血清白蛋白。
11、优选的，该步骤s3为：
12、将神经嵴扩增培养基吸除，加入特异性本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种用于骨关节炎药物的间充质干细胞构建方法，其特征在于，包含如下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种用于骨关节炎药物的间充质干细胞构建方法，其特征在于，所述S3之后还包括S4：将间充质干细胞扩增培养。
3.根据权利要求2所述的一种用于骨关节炎药物的间充质干细胞构建方法，其特征在于，所述S4之后还包括S5：将扩增培养得到的间充质干细胞进行鉴定。
4.根据权利要求1所述的一种用于骨关节炎药物的间充质干细胞构建方法，其特征在于，所述步骤S1之前还包括步骤S0：人多能干细胞的培养。
5.根据权利要求1所述的一种用于骨关节炎药物的间充质干细胞构建方法，其特征在于，该步骤S1为：培养8-10天，所述信号通路调节剂的浓度依次为：500nM、10μM和3μM；所述信号通路调节剂的加入时间依次为：0-2天、0-3天和3-6天；所述的神经嵴细胞诱导培养基由以下成分组成：DMEM/F12培养基、浓度为64mg/L的左旋抗坏血酸、浓度为14μg/L的亚硒酸钠、浓度为10.7mg/L的转铁蛋白、浓度为543mg/L的碳酸氢钠、浓度为19.4mg/L的胰岛
6.根据权利要求1所述的一种用于骨关节炎药物的间充质干细胞构建方法，其特征在于，该步骤S2为：
7.根据权利要求1所述的一种用于骨关节炎药物的间充质干细胞构建方法，其特征在于，该步骤S3为：
8.根据权利要求1所述的一种用于骨关节炎药物的间充质干细胞构建方法，其特征在于，所制备的间充质干细胞，其表达CD90、CD73和CD105，不表达CD14、CD34、CD45和HLA-DR。
9.根据权利要求1所述的一种用于骨关节炎药物的间充质干细胞构建方法，其特征在于，所制备的神经嵴细胞，其表达P75和SOX10，不表达PAX6。
10.根据权利要求1至9的任意一项所述的一种用于骨关节炎药物的间充质干细胞构建方法所构建的间充质干细胞作为骨关节炎药物的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种用于骨关节炎药物的间充质干细胞构建方法，其特征在于，包含如下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种用于骨关节炎药物的间充质干细胞构建方法，其特征在于，所述s3之后还包括s4：将间充质干细胞扩增培养。
3.根据权利要求2所述的一种用于骨关节炎药物的间充质干细胞构建方法，其特征在于，所述s4之后还包括s5：将扩增培养得到的间充质干细胞进行鉴定。
4.根据权利要求1所述的一种用于骨关节炎药物的间充质干细胞构建方法，其特征在于，所述步骤s1之前还包括步骤s0：人多能干细胞的培养。
5.根据权利要求1所述的一种用于骨关节炎药物的间充质干细胞构建方法，其特征在于，该步骤s1为：培养8-10天，所述信号通路调节剂的浓度依次为：500nm、10μm和3μm；所述信号通路调节剂的加入时间依次为：0-2天、0-3天和3-6天；所述的神经嵴细胞诱导培养基由以下成分组成：dmem/f12培养基、浓度为64mg/l的左旋抗坏血酸、浓度为14μg/l的亚硒酸...
【专利技术属性】
技术研发人员：王先流，靳钧，欧阳平，
申请(专利权)人：上海元戊医学技术有限公司，
类型：发明
国别省市：
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