检验鼠疫菌的荧光免疫染色试剂盒制造技术

本发明专利技术涉及动物鼠疫疫情监测与鼠疫诊断技术领域，是一种检验鼠疫菌的荧光免疫染色试剂盒，其包括荧光素标记抗体１支，荧光抗体保存液２ｍｌ×１支，固定液２０ｍｌ×１瓶，１０×稀释液２０ｍｌ×１瓶，鼠疫菌阳性对照２ｍｌ×１支，鼠疫菌阴性对照２ｍｌ×１支，抑制用鼠疫Ｆ１抗体５ｍｌ×１支，１％硫柳汞５ｍｌ×１支；所述萤光素标记抗体为异硫氰酸荧光素标记鼠疫Ｆ１抗体。本发明专利技术的有益效果：被测物经过氧乙醇固定，使检测过程安全；用荧光显微镜观察染色结果，程序简单，全程６０分钟，最小检出量为５００个鼠疫菌体／ｍｌ；抑制试验可提高检测结果的准确性；为动物鼠疫监测和诊断提供了准确、稳定、快速、简便的检验器具。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及动物鼠疫疫情监测与鼠疫诊断
，尤其是能通过荧光显微镜检 查识别鼠疫菌，是一种检验鼠疫菌的荧光免疫染色试剂盒。
技术介绍
鼠疫是由鼠疫杆菌引起的一种自然疫源性烈性传染病，是我国《传染病防治法》规 定的甲类传染病，啮齿类是鼠疫的主要宿主动物和传染源，可自然感染鼠疫动物近200种。 我国已发现12个类型的鼠疫疫源地，分布于19个省区，面积130多万km2。20世纪90年代 以来，一些静息多年的鼠疫自然疫源地动物间鼠疫持续处于活跃状态，人间鼠疫时有发生， 远距离高速度传播的危险性增加。监测动物间鼠疫的流行状况，是预防控制人间鼠疫的重 要工作内容。实验室检验结果是制定实施鼠疫控制措施的重要依据，鼠疫传播速度快，防控鼠 疫应急反应需要快速的检测鼠疫技术。分离培养鼠疫菌最快要24小时才能出结果；胶体金 纸上色谱法、反相间接血凝试验等检测鼠疫菌及其抗原的免疫学方法，可在3小时内出结 果，最小检出量在IO5个菌体/ml，敏感性较低。显微镜检查鼠疫菌，美兰染色为两端浓染，革 兰氏染色为革兰氏阴性杆菌，显微镜检查美兰染色、革兰氏染色的标本速度快，但鼠疫菌和 肠杆菌科的细菌沒有明显差异，没有鉴别意义。根据应急反应的需要，检查鼠疫菌的准确、 稳定、快速、简便的检验鼠疫菌的方法的研究倍受关注。
技术实现思路
本专利技术提供了一种检查动物鼠疫菌的荧光免疫染色试剂盒，克服了现有动物鼠疫 监测与诊断技术中存在的问题。本专利技术是通过应用荧光免疫染色法显示鼠疫菌夹膜中的Fl 抗原，检查各种动物血液、器官、脏器组织中的鼠疫菌，经多次改进，现已制成具体有效的检 查鼠疫菌的荧光免疫染色试剂盒，可准确、稳定、快速、简便鉴定鼠疫菌，供鼠疫监测和诊断 使用。本专利技术的技术方案是通过以下措施来实现的一种检验鼠疫菌的荧光免疫染色 试剂盒，其包括冻干荧光素标记抗体1支，荧光抗体保存液2ml X 1支，固定液20ml X 1瓶， 10 X稀释液20ml X 1瓶，鼠疫菌阳性对照2ml X 1支，鼠疫菌阴性对照2ml X 1支，抑制用鼠 疫Fl抗体5ml X 1支，1 %硫柳汞2ml X 1支；所述萤光素标记抗体为异硫氰酸荧光素标记鼠 疫Fl抗体即FITC-FlAb。对上述本专利技术的技术方案可进一步进行如下的选择或/和优化 上述异硫氰酸荧光素标记鼠疫Fl抗体按下述方法得到(1)抗鼠疫Fl抗原血清，用硫酸铵沉淀法提取鼠疫Fl抗体；(2)含鼠疫Fl抗体20mg的生理盐水溶液27ml，加含异硫氰酸荧光素即FITC2mg的 0. 5mol/LpH9. 5碳酸盐缓冲液3ml，混勻；室温持续搅拌2小时；(3)边摇边缓慢加入饱和硫酸铵水溶液30ml，4°C放置1小时，4000X g离心10分钟，弃 上清；沉淀用生理盐水5ml溶解，边摇边缓慢加入饱和硫酸铵水溶液5ml，4°C放置1小时， 4000Xg离心10分钟，弃上清，再用50%饱和度硫酸铵洗涤沉淀2次，洗除游离异硫氰酸荧 光素即FITC，沉淀用生理盐水5ml溶解，即为FITC-FlAb溶液；(4)将FITC-FlAb溶液装入透析袋，用0.01mol/LpH7. 2磷酸盐缓冲液即PBS在4°C温 度下透析，每6-8小时换0. 01mol/LpH7. 2PBS液1次；将FITC-FlAb溶液移入试管； (5)测定FITC-FlAb适用浓度，用浓度按容量/容量含50%新生小牛血清的0.Olmol/ LpH7. 2PBS稀释，分装，冻干，-20°C保存；在上述方法中溶液浓度除注明外均为重量/容量。本专利技术的有益效果被测物经过氧乙醇固定，使检测过程安全；突出特点是实验 条件简单，用荧光显微镜观察染色结果，全程60分钟，最小检出量为500个鼠疫菌体/ml ； 抑制试验可提高检测结果的准确性；为动物鼠疫监测和诊断提供了准确、快速、简便的检验 器具。具体实施例方式本专利技术不受下述实施例的限制，可依据本专利技术的技术方案和实际情况来确定具体 的实施方式。下述实施例中，无特别说明均为常规方法；溶液浓度除注明外均为重量/容量。实施例1 检查动物鼠疫菌的荧光免疫染色试剂盒制备一、检查动物鼠疫菌的荧光免疫染色试剂盒的组成1.异硫氰酸荧光素标记鼠疫Fl抗体(FITC-FlAb)冻干 1支2.荧光抗体保存液2ml 1支3.固定液20ml 1瓶4.10 X稀释液20ml 1瓶5.鼠疫菌阳性对照(冻干剂)2ml 1支6.鼠疫菌阴性对照(冻干剂)2ml 1支7.抑制用鼠疫Fl抗体(冻干剂)5ml 1支 8.1%硫柳汞 2ml 1支二、试剂盒各组分的制备方法1.制备异硫氰酸荧光素标记鼠疫Fl抗体(FITC-FlAb)(1)抗鼠疫Fl抗原血清，用硫酸铵沉淀法提取鼠疫Fl抗体；(2)含鼠疫Fl抗体20mg的生理盐水溶液27ml，加含异硫氰酸荧光素(以下简称 FITC) 2mg的0. 5mol/LpH9. 5碳酸盐缓冲液3ml，混勻；室温持续搅拌2小时；(3)边摇边缓慢加入饱和硫酸铵水溶液30ml，4°C放置lh，4000Xg离心10分钟，弃 上清；沉淀用生理盐水5ml溶解，边摇边缓慢加入饱和硫酸铵水溶液5ml，4°C放置1小时， 4000 Xg离心10分钟，弃上清，再用50%饱和度硫酸铵洗涤沉淀2次，洗除游离FITC，沉淀 用生理盐水5ml溶解，即为FITC-FlAb溶液；(4)将FITC-FlAb溶液装入透析袋，用0.01mol/LpH7. 2磷酸盐缓冲液即PBS，4°C透析， 每6-8h换液1次；将FITC-FlAb溶液移入试管；(5)测定FITC-FlAb适用浓度，用含50% (容量/容量)新生小牛血清0. Olmol/ LpH7. 2PBS稀释，分装，冻干，-20°C保存。2.荧光抗体保存液0. lmol/LpH7. 2磷酸盐缓冲液与等量丙三醇混合，分装，每支 2ml。3.固定液75%(容量/容量)乙醇100ml，30%(容量/容量)H2O2 5ml，分装，每支 20ml。4. IOX稀释液制备0. lmol/LpH7. 2磷酸盐缓冲液90ml，吐温-205ml，新生小牛血 清IOml，硫柳汞0. 2g，混合溶解分装，每支20ml。5.鼠疫菌阳性对照制备鼠疫菌EV株用0. 01mol/LpH7. 2PBS配制成5% (湿菌重 量/容量)菌液Iml，与含3 % H2O2的95 %酒精5ml混勻，20_37°C室温放置30分钟，4000 X g 离心10分钟，收集菌体，用含30%新生小牛血清0. 01mol/LpH7. 2PBS50ml制成混悬液，分装 每支0. 1ml，冻干。6.鼠疫菌阴性对照制备菌株为大肠杆菌，制备方法与鼠疫菌阳性对照相同。7.抑制用鼠疫Fl抗体0. 01mol/LpH7. 2PBS30ml，加硫柳汞0. Ig,新生小牛血清 10ml，加滴度为1 8000的鼠疫Fl抗体10ml，混勻，分装，每支0. 2ml，冻干。8. 硫柳汞硫柳汞lg，NaCl lg，加蒸馏水至100ml，分装，每支2ml。上述制备好的各种试剂定量分装，装入检查动物鼠疫菌的荧光免疫染色的试剂品.ο实施例2 检查动物鼠疫菌的荧光免疫染色的试剂盒的应用方法 一、检查动物鼠疫菌的荧光免疫染色的器材与试剂配制1.稀释液10X稀释液用0. 85%NaCl溶液稀释10倍。本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检验鼠疫菌的荧光免疫染色试剂盒，其特征在于包括冻干荧光素标记抗体１支，荧光抗体保存液２ｍｌ×１支，固定液２０ｍｌ×１瓶，１０×稀释液２０ｍｌ×１瓶，鼠疫菌阳性对照２ｍｌ×１支，鼠疫菌阴性对照２ｍｌ×１支，抑制用鼠疫Ｆ１抗体５ｍｌ×１支，１％硫柳汞　２ｍｌ×１支；所述萤光素标记抗体为异硫氰酸荧光素标记鼠疫Ｆ１抗体即ＦＩＴＣ－Ｆ１Ａｂ。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：雷刚，热娜吐尔地，蒋卫，丁雄杰，徐兵，唐建国，
申请(专利权)人：新疆维吾尔自治区疾病预防控制中心，
类型：发明
国别省市：65[中国|新疆]