【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种脂肪酸脱羧酶p450bsβ突变体及其在γ-内酯制备中的应用，属于蛋白质领域。
技术介绍
1、γ-内酯是γ位碳原子上的羟基与羧酸脱水缩合形成具有五元环结构的内酯，是自然界内酯中最丰富的类别之一。γ-内酯存在于多种天然产物的结构中，例如γ-癸内酯、γ-丁内酯和α-氨基-γ-内酯等，并且γ-内酯表现出优良的生物活性。例如，γ-癸内酯具有桃子香味，γ-辛内酯具有椰子香味，γ-己内酯具有香草的香味，它们是一类广泛用于饮料、香水和医药制剂中的天然桃香精。γ-内酯的世界市场量已达到每年数百万吨，价值在300-6000美元/公斤，但由于其生产技术的发展而呈下降趋势。此外，一些γ-内酯衍生物还具有抗结核菌(如micromolide)和昆虫信息素等生物活性。因此，γ-内酯的制备受到广泛的关注。
2、化学方法合成简单内酯如γ-内酯的常用方法有环化、还原和氧化。由无机酸、磺酸、对甲苯磺酸和吡啶对甲苯磺酸盐等酸催化的γ-羟基羧酸及其衍生物的环化是最简单高效的γ-内酯合成方法之一，但相应的γ-羟基羧酸仍然难以合成；还原则需要底物γ位含碳基等官能团再反应生成γ-羟基羧酸，而这类底物自然界难以获得，也需要多步的化学合成；将γ位含碳碳双键等基团的底物氧化生成γ-羟基羧酸也能合成γ-内酯，但特定位点含有双键等基团的底物与γ-羟基羧酸有类似的化学构建难度与经济价值。这些方法或者需要繁多的反应步骤、产率较低，或者需要钌、铱等贵金属合成的手性助剂，以及使用化工产品对环境不友好和严苛的反应条件。近年来，生物催化剂也被用于内酯的合成，使得使用绿
3、对羧酸的γ位直接氧化获得γ-羟基羧酸进而环化成γ-内酯是一种理想、直接且经济的制备方法。先前研究表明，用铂和铜或过氧化二硫酸盐作为催化剂对脂肪族羧酸进行氧化内酯化的化学反应性和位点选择性较差。通过外部导向基团引导位点选择性的化学合成的效率也较低。为了在没有外部引导基团的情况下实现反应，利用底物中不同c-h键的固有偏向性开发出的化学催化剂如：通过fe-和mn-(pdp)催化剂可以实现在某些羧酸中富电子和空间位阻大的二、三级c(sp3)-h键的γ-内酯化，而改变这些催化剂的空间位阻性质，可以实现贫电子但空间位阻性小的初级c(sp3)-h键的内酯化。最近研究还发现一种配体控制的钯催化剂可以有效地对二羧酸进行γ-内酯化[38]。在以上这些显著进步中，底物通常需要一定的刚性、取代基模式或补充功能才能达到良好的选择性或反应性，在具有多个相同亚甲基的柔性、线性底物和对映选择性的控制方面仍然存在问题。因此，当前尚未实现柔性脂肪酸的不对称催化γ-c-h内酯化。而在已知的酶中，仅有来源于甲基杆菌(methylobacteriumpopuli)的p450mp在能够实现对c12:0-c18:0脂肪酸β位氧化的主反应的同时，产生微量的γ-羟基脂肪酸副产物。因此，尚无专一直接将脂肪酸γ位羟基化的酶的报道。
技术实现思路
1、本专利技术为了克服现有的技术缺陷，解决金属催化剂催化效率不高、反应活性不强、位点和对映选择性低、底物范围窄等问题，提供了一种脂肪酸脱羧酶p450bsβ突变体及其在γ-内酯制备中的应用。本专利技术提供的脂肪酸脱羧酶p450bsβ突变体能够利用过氧化氢将脂肪酸转化为γ-内酯，该生物催化剂具有反应速率高、底物范围广、体系简单、合成效率高、高区域和对映体选择性及成本低廉等优势。
2、本专利技术脂肪酸脱羧酶p450bsβ突变体，其氨基酸序列如seq id no:1所示。
3、编码所述脂肪酸脱羧酶p450bsβ突变体的核苷酸序列如seq id no:2所示。
4、本专利技术脂肪酸脱羧酶p450bsβ突变体，是将野生型脂肪酸脱羧酶p450bsβ第290位的甘氨酸突变成异亮氨酸，将第173位的苯丙氨酸突变成丝氨酸，将第85位的谷氨酰胺突变成苯丙氨酸，将第78位的亮氨酸突变成甘氨酸后获得，具体包括如下步骤：
5、步骤1：构建表达脂肪酸脱羧酶p450bsβ的质粒：将上述seq id no:2的核苷酸序列经酶切重组到表达载体上；
6、步骤2：将步骤1构建的表达脂肪酸脱羧酶p450bsβ的质粒转化到大肠杆菌中；
7、步骤3：脂肪酸脱羧酶p450bsβ的表达：将步骤2得到的菌种在lb液体培养基中过夜培养，然后加入tb液体培养基中扩培，于对数期后期加入血红素前体δ-氨基乙酰丙酸和iptg诱导表达后，离心收菌；
8、步骤4：含有脂肪酸脱羧酶p450bsβ的细胞裂解液的制备：用缓冲液将步骤3得到的菌体重悬，通过超声破碎裂解细胞，离心，获得上清液；
9、步骤5：脂肪酸脱羧酶p450bsβ的纯化：将步骤4获得的上清液加入事先预处理的镍离子亲和柱，使带有his标签的目的蛋白与镍柱结合，然后于较低咪唑浓度下除去杂蛋白，最后用含有高浓度咪唑的缓冲液将目的蛋白洗脱；
10、步骤6：将洗脱下来的目的蛋白透析以除去咪唑，蛋白经浓缩后冻干制成冻干粉，测定目的蛋白浓度后，-80℃保存。
11、本专利技术脂肪酸脱羧酶p450bsβ突变体的应用，是以c6～c18链长的脂肪酸为底物，以过氧化氢为氧化剂，以脂肪酸脱羧酶p450bsβ突变体为催化剂，催化脂肪酸γ位碳原子上的羟基与羧酸脱水缩合形成γ-内酯。
12、上述催化反应中，反应在室温下进行，反应体系为水相缓冲液体系，以triton x-100(0.625％)，5％dmso(v/v)作为助溶剂。
13、所述缓冲液成分为：0.1m kpi，0.3m kcl，ph 7.0。
14、所述脂肪酸选自c6～c18链长的天然饱和脂肪酸或非天然羧酸。
15、进一步的，所述非天然羧酸的结构中含有末端或内部烯烃或炔烃、溴、酯、胺、腈、对氧敏感的羟基基序、环己基中的一种或多种；所述脂肪酸为含芳环或芳杂环的脂肪酸，其结构中含有n-、o-、s-的杂芳环、噻唑、吡啶、喹啉、苯并噻唑、呋喃、噻吩、噁唑、苯并呋喃、苯并噻吩中的一种或多种官能团。
16、进一步的，所述γ-内酯为s型γ-内酯。
17、本专利技术脂肪酸脱羧酶p450bsβ突变体催化脂肪酸γ位碳原子上的羟基与羧酸脱水缩合形成γ-内酯的方法，包括如下步骤：
18、γ-内酯化的反应体系包括buffera(0.1m kpi，0.3m kcl，ph 7.0)，含脂肪酸脱羧p450bsβ突变体蛋白(2μm)，底物(1mm)，过氧化氢(5mm×3，间隔时间＝5min)，triton x-100(0.625％)，5％dmso(v/v)。其中，triton x-100(0.625％)，5％dms本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种脂肪酸脱羧酶P450BSβ突变体，其特征在于其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
2.编码权利要求1所述脂肪酸脱羧酶P450BSβ突变体的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
3.权利要求1所述脂肪酸脱羧酶P450BSβ突变体的应用，其特征在于：
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：
6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：
8.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：
【技术特征摘要】
1.一种脂肪酸脱羧酶p450bsβ突变体，其特征在于其氨基酸序列如seq id no:1所示。
2.编码权利要求1所述脂肪酸脱羧酶p450bsβ突变体的核苷酸序列如seq id no:2所示。
3.权利要求1所述脂肪酸脱羧酶p450bsβ突变体的应用，其特征在...
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