【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物，具体涉及一种能将脱氧雪腐镰刀菌烯醇(don)一步酶法解毒为无毒的3-异构-脱氧雪腐镰刀菌烯醇(3-epi-don)的双功能融合酶及其制备方法和应用。
技术介绍
1、脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol，don)，又名呕吐毒素(vomitoxin，vt)，是禾谷镰刀菌、黄色镰刀菌等真菌侵染谷物后所产生的有毒次级代谢产物，广泛存在于小麦、玉米等粮谷类原料及其制品中。don已被联合国粮农组织(fao)和世界卫生组织(who)确定为最危险的自然发生食品污染物之一，给粮食和畜牧业造成巨大的经济损失，以及对人和动物的健康造成严重危害，因此，如何有效地控制和解决粮食和饲料中don污染的方法，已成为国内外食品加工和食品安全领域中的研究热点。
2、近年来，霉菌毒素生物降解方法倍受关注。目前对don生物降解的研究主要包括微生物降解法和酶解毒法。已有的研究表明，don分子中c12，13位的环氧基团和c3位上的羟基是don的主要毒性基团，也是生物降解主要研究位点。微生物能够将环氧基团还原成c9，12二烯结构，形成毒性极低的脱环氧产物dom-1(zhai et al.，frontmicrobial.，2019，10，1-12)，未见任何don解毒酶的报道。除环氧基团外，c3位上的羟基生物转化包括：氧化、乙酰化、糖苷化、异构化(michlmayr et al.，toxins.，2015，7，2685-2700；tian et al.，toxins.，2016，8，1-15；zhai et al.，front mi
技术实现思路
1、本专利技术的目的是提供一种双功能融合酶的构建方法，将德沃斯氏菌a6-243编码的don解毒酶基因dadh和akr13b3通过linker组装起来，构建融合表达载体，并实现其在原核细胞中的高效表达；该融合酶能有效的将don直接降解为3-epi-don，可提高酶的催化效率，降低酶的生产成本，在食品和饲料工业中具有潜在的工业化应用前景。
2、针对上述问题，专利技术人从土壤中筛选到100％don降解的德沃斯氏菌(devosia)a6-243。根据don降解产物的结构分析，devosia a6-243对don的转化途径是通过两步酶促反应实现的，即don先被氧化生成3-keto-don，然后3-keto-don被还原生成3-epi-don。通过对该菌株进行基因组注释，结合比较基因组学和转录组学分析，从devosiaa6-243克隆到dadh和akr13b3基因，并在e.coli中实现了异源表达；通过纯化得到纯酶，证实dadh将don氧化生成3-keto-don，再经akr13b3将3-keto-don还原生成3-epi-don，且单向不可逆。
3、为解决上述技术问题，本专利技术采用了以下技术方案：
4、一种双功能融合酶的制备方法，包括以下步骤：
5、(1)对脱氧雪腐镰刀菌烯醇解毒酶基因dadh和akr13b3进行pcr扩增；其中，脱氧雪腐镰刀菌烯醇解毒酶基因dadh的核苷酸序列如seq id no.3所示，氨基酸序列如seq idno.4所示；脱氧雪腐镰刀菌烯醇解毒酶基因akr13b3的核苷酸序列如seq id no.5所示，氨基酸序列如seq id no.6所示；
6、(2)构建不同linker介导的双功能融合酶dadh-akr13b3原核表达载体；
7、(3)将双功能融合酶dadh-akr13b3在宿主细胞中进行表达；
8、其中，双功能融合酶dadh-akr13b3的核苷酸序列如seq id no.1所示，氨基酸序列如seq id no.2所示。
9、其中，步骤(2)所用表达载体为大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短芽孢杆菌、乳酸菌、酵母、链霉菌和丝状真菌中的一种或几种。
10、其中，步骤(3)所用宿主细胞为大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短芽孢杆菌、乳酸菌、酵母、链霉菌或丝状真菌。
11、本专利技术还提供利用上述制备方法制得的双功能融合酶。该双功能融合酶可以作为解毒剂使用，可直接将小麦中的脱氧雪腐镰刀菌烯醇一步酶法解毒为无毒的3-epi-don。
12、上述技术方案中提供的双功能融合酶dadh-akr13b3能将don直接解毒为无毒的3-epi-don，实现don的一步酶法解毒。该融合酶可以将45～150μg/ml的don降解为无毒产物3-epi-don，降解率为100％。
13、本专利技术的双功能融合酶dadh-akr13b3能将小麦中的don直接解毒为无毒的3-epi-don，实现霉变小麦中don的一步酶法解毒，降解率90％以上，有效解决谷物原料及饲料中呕吐毒素污染问题，减少粮食损失，保障食品、饲料安全。
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1.一种双功能融合酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的双功能融合酶的制备方法，其特征在于：步骤S2所用表达载体为大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短芽孢杆菌、乳酸菌、酵母、链霉菌和丝状真菌中的一种或几种。
3.根据权利要求1所述的双功能融合酶的制备方法，其特征在于：步骤S3所用宿主细胞为大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短芽孢杆菌、乳酸菌、酵母、链霉菌或丝状真菌。
4.根据权利要求1所述的双功能融合酶的制备方法，其特征在于，步骤S2包括以下步骤：
5.一种利用权利要求1-4任一项所述的制备方法制得的双功能融合酶。
6.一种如权利要求5所述的双功能融合酶作为解毒剂的应用。
7.一种如权利要求6所述的应用，其特征在于：双功能融合酶将脱氧雪腐镰刀菌烯醇一步酶法解毒为无毒。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：双功能融合酶直接将脱氧雪腐镰刀菌烯醇解毒为无毒的3-epi-DON。
9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：双
...【技术特征摘要】
1.一种双功能融合酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的双功能融合酶的制备方法，其特征在于：步骤s2所用表达载体为大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短芽孢杆菌、乳酸菌、酵母、链霉菌和丝状真菌中的一种或几种。
3.根据权利要求1所述的双功能融合酶的制备方法，其特征在于：步骤s3所用宿主细胞为大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短芽孢杆菌、乳酸菌、酵母、链霉菌或丝状真菌。
4.根据权利要求1所述的双功能融合酶的制备方法，其特征在于，步骤...
【专利技术属性】
技术研发人员：吕凤霞，牛家峰，朱萍，沈娟，朱筱玉，陆兆新，周立邦，孟凡强，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：
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