【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于兽用生物制品，涉及一种重组亚单位融合蛋白reg95-fc及其制备方法，尤其涉及一种重组细粒棘球蚴eg95-fc融合蛋白及其制备方法。
技术介绍
1、棘球蚴病(echinococcosis)，是由棘球蚴属绦虫的幼虫-棘球蚴(hydatid cyst)寄生于人和动物的肺、肝等组织器官而引起的一种严重的人兽共患寄生虫病。棘球蚴病流行广，呈世界性分布，世界动物卫生组织(world organization for animal health；法语：office international desépizooties，oie)将棘球蚴病归为全球通报的传染病，归属为多种动物共患病；世界卫生组织(world health organization，who)将棘球蚴病列为全球早期预警系统优先预测和应急处置的疾病之一。棘球蚴病也是中国卫生部规划防治的五大寄生虫病之一。
2、根据病灶的形态及感染病原的差异，棘球蚴病主要分为细粒棘球蚴病(cysticechinococcosis,ce)和多房棘球蚴病两种，其中细粒棘球蚴病分布最广，患者人数最多。ce的致病原目前由几个棘球绦虫复合种构成：狭义细粒棘球绦虫(echinococcusgranulosus)、加拿大棘球绦虫(echinococcus.canadensis)、马棘球绦虫、奥氏棘球绦虫，其中由狭义细粒棘球绦虫g1型引起的ce超过90％，而由加拿大棘球蚴绦虫g6型引起的ce超过7％。
3、目前研究表明控制棘球蚴病的流行主要是通过切断棘球绦虫发育环节，控制人、畜等
技术实现思路
1、为解决现有技术中细粒棘球蚴亚单位疫苗中抗原表达量低、可溶性差和免疫持续期短的问题，本专利技术提出了一种能稳定高效表达细粒棘球蚴eg95抗原和羊免疫球蛋白fc的亚单位融合蛋白reg95-fc及其在cho或293t细胞系统中构建和表达方法。本专利技术针对羊igg中的fc片段筛选了可显著增加fc融合蛋白免疫持续期的突变体，其序列如seq id no.4所示。本专利技术获得的可以分泌表达亚单位融合蛋白reg95-fc的单克隆细胞株，表达产量高，经一步亲和层析即可获得大量的融合蛋白。
2、本专利技术的目的是通过以下技术方案来实现的：
3、<第一方面>
4、本专利技术提供一种重组亚单位融合蛋白reg95-fc，含有细粒棘球蚴eg95抗原和羊的抗体fc蛋白片段，所述抗体fc蛋白片段
5、为羊的igg的重链恒定区片段，其氨基酸序列如seq id no.3所示；
6、或，为羊的igg的重链恒定区片段的突变体，其氨基酸序列如seq id no.4所示。
7、作为一个实施方案，所述细粒棘球蚴eg95抗原的氨基酸序列如seq id no.2所示。
8、作为一个实施方案，所述eg95抗原与羊的抗体fc蛋白片段通过富含甘氨酸和丝氨酸的linker连接。
9、作为一个实施方案，所述linker序列为gggsgggsgggs。
10、作为一个实施方案，所述eg95抗原位于linker的n端，所述fc蛋白片段位于linker的c端；或所述eg95抗原位于linker的c端，所述fc蛋白片段位于linker的n端。
11、作为一个实施方案，所述融合蛋白reg95-fc，
12、为氨基酸序列如seq id no.1所示的蛋白；
13、或，为如seq id no.1所示的氨基酸序列包括经过取代、缺失或添加一个氨基酸或几个氨基酸且具有免疫原性的衍生的蛋白；
14、或，为在如seq id no.1所示的氨基酸序列上颠倒eg95和fc的顺序并且将fc放置在氨基端的衍生的蛋白。
15、作为一个实施方案，所述融合蛋白reg95-fc为氨基酸序列如seq id no.12所示的蛋白。
16、作为一个实施方案，所述融合蛋白reg95-fc的氨基酸序列的氨基末端或羧基末端上连接有一种或多种标签。
17、作为一个实施方案，所述标签选自poly-arg、poly-his、flag、c-myc和ha。
18、根据本专利技术所述的重组亚单位融合蛋白reg95-fc的技术方案，优选地，在seq idno.1所示的氨基酸序列的氨基末端或羧基末端上连接poly-arg、poly-his、flag、c-myc和ha中的一种或多种标签氨基酸。
19、作为一个实施方案，所述融合蛋白reg95-fc的表达系统包括但不限于哺乳动物细胞以及昆虫细胞。
20、作为一个实施方案，所述昆虫细胞为sf9细胞、sf21细胞、high five细胞。
21、作为一个实施方案，所述哺乳动物细胞为cho细胞、293t细胞。更优选地，所述哺乳动物细胞为cho细胞。
22、<第二方面>
23、本专利技术提供了一种重组亚单位融合蛋白reg95-fc的制备方法，所述方法包括如下步骤：
24、s1、将reg95-fc融合蛋白编码的基因克隆到真核表达载体中得到含有reg95-fc融合蛋白编码基因的重组质粒；
25、s2、再将含有reg95-fc融合蛋白编码基因的重组质粒转染至cho细胞株中；
26、s3、通过培养、筛选、驯化步骤s2中得到的cho细胞株得到高度表达的细胞株；
27、s4、发酵培养所述高度表达的细胞株，纯化后得到reg95-fc融合蛋白。
28、作为一个实施方案，步骤s1中，reg95-fc融合蛋白编码的基因如seq id no.5或seq id no.6所示。
29、作为一个实施方案，所述真核表达载体为哺乳动物细胞表达载体。优选地，所述真核表达载体为pee6.4、pee12.4、pgl4.13、pcdna3.1，更优选地，所述真核表达载体为pcdna3.1。
30、作为一个实施方案，用于表达重组亚单位融合蛋白reg95-fc的细胞为cho细胞，优选地，所述cho细胞株为dg44、dxb11、cho-k1或cho-s细胞株。更优选地，所述cho细胞株为cho-k1。
31、<第三方面>
32、本专利技术提供了一种cho细胞株3f4-reg95-fc(cho 3f4-reg95-fc)，保藏编号为cctcc no:c2022186。
33、本专利技术中，中国仓鼠卵巢细胞2h1--本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种重组亚单位融合蛋白rEG95-Fc，含有细粒棘球蚴EG95抗原和羊的抗体Fc蛋白片段；所述抗体Fc蛋白片段
2.根据权利要求1所述的重组亚单位融合蛋白rEG95-Fc，其特征在于，所述细粒棘球蚴EG95抗原的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
3.根据权利要求1所述的重组亚单位融合蛋白rEG95-Fc，其特征在于，所述EG95抗原与羊的抗体Fc蛋白片段通过富含甘氨酸和丝氨酸的linker连接；所述linker序列为GGGSGGGSGGGS。
4.根据权利要求3所述的重组亚单位融合蛋白rEG95-Fc，其特征在于，所述EG95抗原位于linker的N端，所述Fc蛋白片段位于linker的C端；或所述EG95抗原位于linker的C端，所述Fc蛋白片段位于linker的N端。
5.根据权利要求1所述的重组亚单位融合蛋白rEG95-Fc，其特征在于，所述融合蛋白rEG95-Fc，
6.根据权利要求1-5中任一项所述的重组亚单位融合蛋白rEG95-Fc，其特征在于，所述融合蛋白rEG95-Fc的氨基酸序列的氨基末端
7.根据权利要求1所述的重组亚单位融合蛋白rEG95-Fc，其特征在于，所述融合蛋白rEG95-Fc的表达系统包括但不限于哺乳动物细胞以及昆虫细胞；所述昆虫细胞为Sf9细胞、Sf21细胞或High Five细胞；所述哺乳动物细胞为CHO细胞或293T细胞。
8.一种根据权利要求1-7中任一项所述的重组亚单位融合蛋白rEG95-Fc的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
9.根据权利要求8所述的重组亚单位融合蛋白rEG95-Fc的制备方法，其特征在于，所述真核表达载体为pEE6.4、pEE12.4、pGL4.13或pcDNA3.1；所述CHO细胞株为DG44、DXB11、CHO-K1或CHO-S细胞株。
10.一种中国仓鼠卵巢细胞3F4-rEG95-Fc，保藏编号为CCTCC NO:C2022186。
...【技术特征摘要】
1.一种重组亚单位融合蛋白reg95-fc，含有细粒棘球蚴eg95抗原和羊的抗体fc蛋白片段；所述抗体fc蛋白片段
2.根据权利要求1所述的重组亚单位融合蛋白reg95-fc，其特征在于，所述细粒棘球蚴eg95抗原的氨基酸序列如seq id no.2所示。
3.根据权利要求1所述的重组亚单位融合蛋白reg95-fc，其特征在于，所述eg95抗原与羊的抗体fc蛋白片段通过富含甘氨酸和丝氨酸的linker连接；所述linker序列为gggsgggsgggs。
4.根据权利要求3所述的重组亚单位融合蛋白reg95-fc，其特征在于，所述eg95抗原位于linker的n端，所述fc蛋白片段位于linker的c端；或所述eg95抗原位于linker的c端，所述fc蛋白片段位于linker的n端。
5.根据权利要求1所述的重组亚单位融合蛋白reg95-fc，其特征在于，所述融合蛋白reg95-fc，
6.根据权利要求1-5中任一项所述的重组亚单位融合蛋白reg95-fc，其特...
【专利技术属性】
技术研发人员：殷波，翟伟锋，王锋，张震，仲从浩，
申请(专利权)人：申联生物医药上海股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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