【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因编辑，尤其涉及一种crispr/spry的检测体系及其检测基因突变的方法。
技术介绍
1、聚集规则穿插短回文重复序列(crispr)/cas9系统被广泛用于诱导靶向dna修饰以产生基因编辑产品。近年来，crispr/cas9系统已被用于生产各种生物的基因工程突变体和育种系，如水稻、油菜、玉米、小麦、大豆、烟草、拟南芥等。这些基因编辑产品均涉及安全监管问题，对基因组编辑产品进行安全监管的前提是建立对基因组编辑产品进行识别和准确定量检测的技术。然而，基因编辑检测与传统的转基因检测不同的是，转基因一般会定点的插入作物原本没有的外源基因片段，可以通过检测外源的元件来进行识别。但是crispr介导的基因编辑突变类型多样化，甚至会出现单碱基的插入或缺失，对检测方法的灵敏度要求较高，大大增加了检测难度。因此，迫切需要开发有效、准确和简单的方法来检测基因编辑产品。目前主流的基因编辑检测方法可以分为三类；基于pcr、基于测序以及基于crispr系统的方法。
2、基于pcr的方法通常基于靶区pcr扩增或者扩增子的各种可视化工具，如临界温度退火pcr(act-pcr)、高分辨率熔化(hrm)、异源双链迁移率测定(hma)结合聚丙烯酰胺凝胶电泳和t7ei错配酶测定。或者通过使用针对特定已知突变位点的引物，例如定量pcr(qpcr)、双链dpcr(ddpcr)、gef-dpcr。酶消化抑制的pcr涉及用各种酶消化和pcr步骤对基因组dna进行联合预处理，例如限制性酶消化抑制pcr(re-pcr)。而基于测序的方法通常可以提供
3、虽然这些检测方法具有一定优势，但仍然存在挑战和不足，如操作繁琐复杂，效率低，成本高，或依赖大型仪器设备。相比之下，基于crispr系统的方法能够一定程度上克服这些问题。如wang等人开发的基于crispr/cas12a的基因编辑水稻检测生物传感平台。如wang等人曾利用ttago介导的定量pcr分析crispr/cas诱导的突变体，可以鉴别基因编辑突变体并分辨基因型，还能评估基因编辑频率。虽然该方法功能齐全，不过根据christie等人的实验，他们所用的ttago切割效率并不高。还有li等人所开发的基于crispr/cas9体外切割的cc-qpcr法，但是传统cas9蛋白识别的pam序列是5'-ngg-3'，其中n代表任意核苷酸。如果pam序列匹配正确，并且sgrna成功地与目标位点结合，那么cas9/sgrna复合体会结合到sgrna与同源序列匹配的靶位点上，进行dna双链的切割。由于这种对pam的识别限制了靶向性并影响了切割效率和灵活性。虽然其他天然存在的cas同源物原则上可以通过识别不同的非标准pams来扩大靶向性，但绝大多数cas9酶需要扩展的基序，这限制了它们在基因组编辑和检测中的用途。因此，pam要求阻止crispr靶位点的准确定位，并且是基因组编辑应用程序的主要障碍。
4、为了克服pam的限制，walton等人设计了一种几乎没有pam的crispr/cas变体，名为spry。spry识别的pam序列为nrn(r为a/g)以及部分nyn(y为c/t)，与野生型cas9的pam序列相比，可供选择的靶点更多，极大的解除了pam的限制。所以spry在体外能够对dna分子进行高度精确的切割。sprygests的实现克服了res、经典crispr-cas酶和其他核酸酶的靶向限制，允许单核苷酸分辨率的dna切割。并且几乎消除了对dna靶向crispr酶的pam需求，使精确核酸酶和碱基编辑应用成为可能。
技术实现思路
1、有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种crispr/spry的检测体系及其检测基因突变的方法，该crispr/spry的检测体系能够快速检测基因突变，且检测灵敏度高。
2、为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供了以下技术方案：
3、本专利技术提供了一种crispr/spry的检测体系，所述检测体系包括以下含量的成分：
4、0.5ng/μl spry蛋白2～3μl和650ng/μl sgrna2.5～3.5μl。
5、优选的，所述sgrna的核苷酸序列如seq id no.4所示。
6、本专利技术还提供了一种crispr/spry的检测体系，所述检测体系包括检测体系a和检测体系b，所述的检测体系a为上述的检测体系；
7、所述检测体系b包括rpa引物对和探针，所述rpa引物对的上游引物的核苷酸序列如seq id no.8～seq id no.10所示，所述rpa引物对的下游引物的核苷酸序列如seq idno.11～seq id no.13所示，所述探针的核苷酸序列如seq id no.14所示。
8、优选的，所述探针修饰有fam基团、thf基团和bhq基团；
9、所述上游引物的浓度为8～12μm、所述下游引物的浓度为8～12μm，所述探针的浓度为10μm；
10、所述上游引物、下游引物与探针的体积比为1:1:0.5～0.7。
11、本专利技术还提供了一种利用上述的检测体系检测基因突变的方法，将待测基因的基因组dna与所述的检测体系孵育，得到孵育后的产物，通过凝胶电泳或qpcr检测孵育后的产物，通过凝胶电泳或qpcr扩增曲线结果判断待测基因是否发生突变。
12、优选的，当利用凝胶电泳结果判断时，电泳图谱中出现一条清晰的条带，表明该待测基因为突变基因或含有突变基因；
13、当利用qpcr扩增曲线结果判断时，以wt样本的rfu值作为参考基准，当待测样本的rfu值高于参考基准，待测基因为突变基因或含有突变基因。
14、优选的，所述孵育的温度为35～38℃，所述孵育的时间为55～65min；
15、所述待测基因的基因组dna、spry蛋白与sgrna的质量比为50:1～1.5:1625～2275。
16、本专利技术还提供了一种利用上述的检测体系可视化检测基因突变的方法，将待检测基因的基因组dna与所述的检测体系a孵育，得到孵育后的产物，将孵育后的产物与所述的检测体系b反应，通过反应溶液的颜色变化判断待测基因是否发生突变。
17、优选的，当待测基因的反应溶液荧光颜色与阴性对照相比，有明显的绿色荧光，表明该待测基因为突变基因或含有突变基因，当待测基因的反应溶液荧光颜色与阴性对照相比，无明显差异，表明该待测基因为非突变基因。
18、优选的，所述反应的温度为35～38℃，所述反应的时间为12～16min；
19、所述待测基因的基因组dna、spry蛋白与sgrna的质量比为50:1～1.5:1625～2275。
20、相对于现有技术，本专利技术具有如下有益效果：
21、本专利技术提供了一种crispr/spry的检测体系及其检测基因突变的方法，使用核酸酶spry识别和切割wt基因组dna，而突变基因本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种CRISPR/SpRY的检测体系，其特征在于，所述检测体系包括以下含量的成分：
2.根据权利要求1所述的检测体系，其特征在于，所述sgRNA的核苷酸序列如SEQ IDNo.4所示。
3.一种CRISPR/SpRY的检测体系，其特征在于，所述检测体系包括检测体系a和检测体系b，所述的检测体系a为权利要求1或2所述的检测体系；
4.根据权利要求4所述的检测体系，其特征在于，所述探针修饰有FAM基团、THF基团和BHQ基团；
5.一种利用权利要求1或2所述的检测体系检测基因突变的方法，其特征在于，将待测基因的基因组DNA与所述的检测体系孵育，得到孵育后的产物，通过凝胶电泳或qPCR检测孵育后的产物，通过凝胶电泳或qPCR扩增曲线结果判断待测基因是否发生突变。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，当利用凝胶电泳结果判断时，电泳图谱中出现一条清晰的条带，表明该待测基因为突变基因或含有突变基因；
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述孵育的温度为35～38℃，所述孵育的时间为55～65min；>
8.一种利用权利要求3或4所述的检测体系可视化检测基因突变的方法，其特征在于，将待检测基因的基因组DNA与所述的检测体系a孵育，得到孵育后的产物，将孵育后的产物与所述的检测体系b反应，通过反应溶液的颜色变化判断待测基因是否发生突变。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，当待测基因的反应溶液荧光颜色与阴性对照相比，有明显的绿色荧光，表明该待测基因为突变基因或含有突变基因，当待测基因的反应溶液荧光颜色与阴性对照相比，无明显差异，表明该待测基因为非突变基因。
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述反应的温度为35～38℃，所述反应的时间为12～16min；
...【技术特征摘要】
1.一种crispr/spry的检测体系，其特征在于，所述检测体系包括以下含量的成分：
2.根据权利要求1所述的检测体系，其特征在于，所述sgrna的核苷酸序列如seq idno.4所示。
3.一种crispr/spry的检测体系，其特征在于，所述检测体系包括检测体系a和检测体系b，所述的检测体系a为权利要求1或2所述的检测体系；
4.根据权利要求4所述的检测体系，其特征在于，所述探针修饰有fam基团、thf基团和bhq基团；
5.一种利用权利要求1或2所述的检测体系检测基因突变的方法，其特征在于，将待测基因的基因组dna与所述的检测体系孵育，得到孵育后的产物，通过凝胶电泳或qpcr检测孵育后的产物，通过凝胶电泳或qpcr扩增曲线结果判断待测基因是否发生突变。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，当利用凝胶电泳结果判断时，电...
【专利技术属性】
技术研发人员：彭城，徐俊锋，苏志勋，汪小福，陈笑芸，丁霖，鲁宇文，
申请(专利权)人：浙江省农业科学院，
类型：发明
国别省市：
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