【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及酶工程，具体涉及一种pet降解酶pet-mh183/208突变体及其编码基因、工程菌和应用。
技术介绍
1、聚对苯二甲酸乙二醇酯(pet)是一种高度结晶聚合物，由对苯二甲酸二甲酯与乙二醇酯交换或以对苯二甲酸与乙二醇酯化合成对苯二甲酸双羟乙酯后再经缩聚反应制得。与其他塑料相比，pet具有出色的耐磨性、高弯曲模量、优异的稳定性等优点，使其广泛应用于食品、化妆品、化学品的包装材料，还能应用于精密仪器、电子电器零部件等领域。
2、pet在自然条件下几乎无法自行降解，因此，随着pet的广泛使用，pet材质的废弃品成为不可忽视的问题。生物降解法酶或微生物将pet降解成单体分子对苯二甲酸(tpa)和乙二醇，相对于化学法、物理法等易造成二次污染且需依赖能源和资源的方法来说，具有常温常压、降解产物单一且易于回收、绿色环保等优势，但存在酶稳定性差、催化效率低等问题。目前已有一些降解效率相对较高的pet降解酶，但其降解pet的工艺需要通过高温熔融重结晶和破碎机的微粉化来降低pet的高结晶度和疏水表面对pet酶解的影响，该过程复杂且成本较高。
技术实现思路
1、针对以上技术问题，本专利技术提供了一种pet降解酶pet-mh183/208突变体及其编码基因、工程菌和应用，该pet降解酶pet-mh183/208突变体具有较高的pet降解活性，并且对高结晶度pet也能高效降解，从而能够简化pet降解工艺，降低成本。
2、为达到上述专利技术目的，本专利技术采用了如下的技术方
3、第一方面，本专利技术提供一种pet降解酶pet-mh183/208突变体，该突变体是将氨基酸序列如seq id no.1所示的蛋白质中第183和208位的氨基酸共同进行突变而得。
4、氨基酸序列如seq id no.1所示的蛋白质对pet降解酶具有良好的降解活性，本专利技术通过在该蛋白质的氨基酸序列中对上述两个位点的氨基酸进行共同突变能够获得协同效果，所得pet-mh183/208突变体相对于仅对第183位或第208位氨基酸进行突变所得突变体的性能大幅度提升，对pet具有更高的降解活性，该降解活性不仅体现在对低结晶度pet的高效降解，还体现在对更难降解的高结晶度pet的高效降解，能够简化高结晶度pet的降解工艺，且tpa和mhet产量均较高。因此，该突变体可用于不同结晶度pet的规模转化生物降解和单体回收。
5、结合第一方面，优选将第183位的氨基酸突变为l-酪氨酸。
6、结合第一方面，优选将第208位的氨基酸突变为l-苏氨酸。
7、第二方面，本专利技术还提供上述pet降解酶pet-mh183/208突变体在水解pet中的应用：向80～120mm、ph值为7.5～8.5的磷酸钾缓冲液中加入所述pet降解酶pet-mh183/208突变体至终浓度为5～15μg/ml，在65～75℃，100～220rpm条件下进行pet降解。
8、第三方面，本专利技术还提供编码pet降解酶pet-mh183/208突变体的基因，所述pet降解酶pet-mh183/208突变体的氨基酸序列如seq id no.2所示，其核苷酸序列如seq id no.3所示。
9、第四方面，本专利技术还提供含有上述核苷酸序列的重组质粒。
10、第五方面，本专利技术还提供上述重组质粒的构建方法：以编码上述突变体核苷酸序列为模板，利用对应引物构建单点突变，先通过pcr反应对目的基因进行指数扩增，然后利用限制性内切酶dpn i去除模板链，利用接着dna连接酶快速环化pcr产物，获得重组质粒。
11、第六方面，本专利技术还提供用上述重组质粒构建的工程菌。
12、结合第六方面，所述工程菌为大肠杆菌。
13、第七方面，本专利技术还提供上述工程菌的构建方法：将上述重组质粒转化入bl21(de3)感受态细胞，涂布于氨苄青霉素平板培养基，得到阳性重组子，即为所述工程菌。
14、第八方面，本专利技术还提供上述工程菌在降解pet中的应用。
15、示例性地，用上述工程菌降解pet的方法可参考如下操作：将上述工程菌在lb液体培养基中培养至od600值达到0.8-1.0范围内，添加诱导剂iptg(异丙基β-d-1-硫代半乳糖吡喃糖苷)至浓度0.1～0.15mm，15～17℃诱导表达20～24h；
16、将发酵培养物在离心，用破菌缓冲液吹吸重悬，再次离心，获得含pet降解酶pet-mh183/208突变体的粗酶液；将粗酶液进行蛋白纯化后浓缩，作为降解pet的生物催化剂；
17、向待降解的pet薄膜底物，加入pet反应液中，在65-75℃下进行生物催化反应，pet反应液中含有ph＝8.0磷酸钾缓冲液以及降解pet的生物催化剂。
18、本专利技术的有益效果在于：本专利技术提供的pet降解酶pet-mh183/208突变体对于不同结晶度的pet均具有较高的降解活性，催化效率高，tpa和mhet产量，可用于pet废弃物的资源再生和二次开发，所得产物能够用于再次生产pet，从而缓解生产pet所需的石油资源的压力，提高pet的回收价值，同时还能解决pet废弃物造成严重的环境污染问题。
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1.一种PET降解酶PET-mh183/208突变体，其特征在于，所述PET降解酶PET-mh183/208突变体是将如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列中第183和208位的氨基酸共同进行突变而得。
2.根据权利要求1所述的PET降解酶PET-mh183/208突变体，其特征在于，将第183位的氨基酸突变为L-酪氨酸；和/或
3.权利要求1或2所述的PET降解酶PET-mh183/208突变体在水解PET中的应用，其特征在于，向80～120mM、pH值为7.5～8.5的磷酸钾缓冲液中加入所述PET降解酶PET-mh183/208突变体至终浓度为5～15μg/mL，在65～75℃，100～220rpm条件下进行PET降解。
4.编码权利要求1所述的PET降解酶PET-mh183/208突变体的基因，其特征在于，所述PET降解酶PET-mh183/208突变体的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，其核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。
5.含有权利要求4所述核苷酸序列的重组质粒。
6.权利要求5所述的重组质粒的
7.用权利要求5所述的重组质粒构建的工程菌。
8.根据权利要求7所述的工程菌，其特征在于，所述工程菌为大肠杆菌。
9.权利要求8所述的工程菌的构建方法，其特征在于，将权利要求5所述重组质粒转化入BL21(DE3)感受态细胞，涂布于氨苄青霉素平板培养基，得到阳性重组子，即为所述工程菌。
10.权利要求7或8所述的工程菌在降解PET中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种pet降解酶pet-mh183/208突变体，其特征在于，所述pet降解酶pet-mh183/208突变体是将如seq id no.1所示的氨基酸序列中第183和208位的氨基酸共同进行突变而得。
2.根据权利要求1所述的pet降解酶pet-mh183/208突变体，其特征在于，将第183位的氨基酸突变为l-酪氨酸；和/或
3.权利要求1或2所述的pet降解酶pet-mh183/208突变体在水解pet中的应用，其特征在于，向80～120mm、ph值为7.5～8.5的磷酸钾缓冲液中加入所述pet降解酶pet-mh183/208突变体至终浓度为5～15μg/ml，在65～75℃，100～220rpm条件下进行pet降解。
4.编码权利要求1所述的pet降解酶pet-mh183/208突变体的基因，其特征在于，所述pet降解酶pet-mh183/208...
【专利技术属性】
技术研发人员：齐崴，尤生萍，王梦凡，郑昀欣，林伟，苏荣欣，
申请(专利权)人：源天生物科技天津有限公司，
类型：发明
国别省市：
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