【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因工程，涉及一种重组亚单位融合蛋白疫苗及其制备方法和应用；尤其涉及一种抗棘球蚴感染的重组亚单位融合蛋白疫苗及其制备方法。
技术介绍
1、棘球蚴病(echinococcosis)是由棘球蚴属绦虫的幼虫——棘球蚴(hydatidcyst)寄生于人和动物的肺、肝等组织器官而引起的一种严重的人兽共患寄生虫病。棘球蚴病流行广，呈世界性分布，世界动物卫生组织(world organization for animal health；法语：office international desépizooties，oie)将棘球蚴病归为全球通报的传染病，归属为多种动物共患病；世界卫生组织(world health organization，who)将棘球蚴病列为全球早期预警系统优先预测和应急处置的疾病之一。棘球蚴病也是中国卫生部规划防治的五大寄生虫病之一。
2、根据病灶的形态及感染病原的差异，棘球蚴病主要分为细粒棘球蚴病(cysticechinococcosis,ce)和多房棘球蚴病两种，其中细粒棘球蚴病分布最广，患者人数最多。ce的致病原目前由几个棘球绦虫复合种构成：狭义细粒棘球绦虫(echinococcusgranulosus)、加拿大棘球绦虫(echinococcus.canadensis)、马棘球绦虫、奥氏棘球绦虫，其中由狭义细粒棘球绦虫g1型引起的ce超过90％，而由加拿大棘球蚴绦虫g6型引起的ce超过7％。
3、目前研究表明控制棘球蚴病的流行主要是通过切断棘球绦虫发育环节，控制人、畜等中间宿主对棘
技术实现思路
1、鉴于上述现有技术中存在的缺陷，本专利技术的目的是提出重组亚单位融合蛋白疫苗及其制备方法和应用；该疫苗可以预防棘球蚴的感染，具有免疫原性好、免疫持续期长、安全、高效、成本低等诸多优点；进一步，本专利技术筛选了一段来源于羊的多肽sl9988，根据序列预测为羊胸腺β肽类似物，通过羊只免疫实验结果得知，添加sl9988可以有效提高该疫苗的抗体效价和抗体持续期。
2、<第一方面>
3、本专利技术提供一种抗棘球蚴重组亚单位融合蛋白疫苗，包含免疫原的reg95-fc融合蛋白和药学上可以接受的载体；其中，所述reg95-fc融合蛋白为氨基酸序列如seq id no.1所示的蛋白，或为如seq id no.1所示的氨基酸序列包括经过取代、缺失或添加一个氨基酸或几个氨基酸且具有免疫原性的衍生的蛋白。本专利技术的抗棘球蚴重组亚单位融合蛋白疫苗二次免疫后第4周即能达到1:512以上的抗体效价，且能维持超过24周的高滴度抗体效价。
4、作为本专利技术的一种实施方式，所述衍生的蛋白，其氨基酸序列如seq id no.2所示。
5、作为本专利技术的一种实施方式，本专利技术所述的抗棘球蚴重组亚单位融合蛋白疫苗中reg95-fc融合蛋白抗原含量为20-100μg/ml。
6、抗抗棘球蚴重组亚单位融合蛋白疫苗中，所述的reg95-fc融合蛋白抗原含量可选自20μg/ml、30μg/ml、40μg/ml、50μg/ml、60μg/ml、70μg/ml、80μg/ml、90μg/ml、100μg/ml。
7、即使当抗棘球蚴重组亚单位融合蛋白疫苗中reg95-fc融合蛋白抗原含量仅为40μg/ml，二次免疫后第4周也能达到1:128以上的抗体效价，且能维持长时期的高滴度的抗体效价。
8、作为本专利技术的一种优选实施方式，本专利技术所述的抗棘球蚴重组亚单位融合蛋白疫苗中reg95-fc融合蛋白抗原含量为60μg/ml。
9、作为本专利技术的一种实施方式，本专利技术所述的抗棘球蚴重组亚单位融合蛋白疫苗中，所述药学上可以接受的载体包括佐剂。
10、所述佐剂包括：(1)白油、铝胶佐剂、皂苷、阿夫立定、dda；(2)油包水乳剂、水包油乳剂、水包油包水乳剂；(3)丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物、顺丁烯二酸酐和链烯基衍生物的共聚物；以及ribi佐剂系统、blockco-polymer、saf-m、单磷酰脂质a、avridine脂质-胺佐剂、大肠杆菌不耐热肠毒素、霍乱毒素、ims1314、胞壁酰二肽、montanide isa206、50v、gel佐剂中的一种或几种；优选地，montanide isa50v。
11、作为本专利技术的一种实施方式，所述佐剂含量为5％-60％v/v，优选从20％-60％v/v，更优选50％v/v。
12、作为本专利技术的一种实施方式，所述的药学上可接受的载体包括药物、免疫刺激剂、抗氧化剂、表面活性剂、着色剂、挥发性油、缓冲剂、分散剂、推进剂和防腐剂中的一种或几种。
13、作为本专利技术的一种实施方式，所述免疫刺激剂包括α-干扰素、β-干扰素、γ-干扰素、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(gm-csf)、巨噬细胞集落刺激因子(m-csf)和白介素2(il2)、有免疫增强作用的多肽。优选地，一种来源于羊的多肽sl9988，序列如seqidno.3。
14、作为本专利技术的一种实施方式，所述药学上可接受的载体包括免疫刺激剂，所述抗棘球蚴重组亚单位融合蛋白疫苗中免疫刺激剂含量为5ug/ml-20ug/ml。优选所述抗棘球蚴重组亚单位融合蛋白疫苗中免疫刺激剂含量为10ug/ml。
15、为了制备这样的组合物，可以使用本领域公知的方法。
16、<第二方面>
17、本专利技术提供一种制备抗棘球蚴重组亚单位融合蛋白疫苗的方法，所述方法包括如下步骤：
18、s1、将编码reg95-fc融合蛋白的基因分别扩增、克隆到表达载体，得到含有reg95-fc融合蛋白基因的重组表达载体；
19、s2、将所述步骤s1得到的含有reg95-fc融合蛋白基因的重组表达载体转染宿主细胞，得到含有所述重组表达载体的稳转细胞株；
20、s3、培养所述步骤s2得到的细胞，表达reg95-fc融合蛋白；
21、s4、纯化所述步骤s3得到的reg95-fc融合蛋白，加入药学上可以接受的载体，得到所述抗棘球蚴重组亚单位融合蛋白疫苗。
22、在一些实施例中，所述方法包括：1)将reg95-fc融合蛋白编码的基因克隆到真核表达载体中得到含有reg95-fc融合蛋白编码基因的重组质粒；2)再将含有reg95-fc融合蛋白编码基因的重组质粒转染至cho细胞株中；3)通过培养、筛选、驯化2)中所述的cho细胞株本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种抗棘球蚴重组亚单位融合蛋白疫苗，其特征在于，包含免疫原的rEG95-Fc融合蛋白和药学上可以接受的载体；其中，所述rEG95-Fc融合蛋白为氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的蛋白，或为如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列包括经过取代、缺失或添加一个氨基酸或几个氨基酸且具有免疫原性的衍生的蛋白。
2.根据权利要求1所述的抗棘球蚴重组亚单位融合蛋白疫苗，其特征在于，所述衍生的蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
3.根据权利要求1所述的抗棘球蚴重组亚单位融合蛋白疫苗，其特征在于，所述rEG95-Fc融合蛋白含量为20-100μg/mL。
4.根据权利要求1所述的抗棘球蚴重组亚单位融合蛋白疫苗，其特征在于，所述药学上可以接受的载体包括佐剂，所述佐剂包括：(1)白油、铝胶佐剂、皂苷、阿夫立定、DDA；(2)油包水乳剂、水包油乳剂、水包油包水乳剂；(3)丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物、顺丁烯二酸酐和链烯基衍生物的共聚物；以及RIBI佐剂系统、Blockco-polymer、SAF-M、单磷酰脂质A、Avridine脂质-胺佐剂、
5.根据权利要求1所述的抗棘球蚴重组亚单位融合蛋白疫苗，其特征在于，所述药学上可接受的载体包括药物、免疫刺激剂、抗氧化剂、表面活性剂、着色剂、挥发性油、缓冲剂、分散剂、推进剂和防腐剂中的一种或几种；所述免疫刺激剂包括α-干扰素、β-干扰素、γ-干扰素、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子GM-CSF、巨噬细胞集落刺激因子M-CSF、白介素2IL2、有免疫增强作用的多肽中的一种或几种；所述多肽包括来源于羊的多肽SL9988，序列如SEQ IDNo.3所示。
6.根据权利要求1所述的抗棘球蚴重组亚单位融合蛋白疫苗，其特征在于，所述药学上可接受的载体包括免疫刺激剂，所述抗棘球蚴重组亚单位融合蛋白疫苗中免疫刺激剂含量为10ug/mL。
7.一种根据权利要求1所述的抗棘球蚴重组亚单位融合蛋白疫苗的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
8.根据权利要求7所述的抗棘球蚴重组亚单位融合蛋白疫苗的制备方法，其特征在于，步骤S1中，编码rEG95-Fc融合蛋白的基因序列如SEQ ID NO.4所示；步骤S3中，表达的rEG95-Fc融合蛋白为细胞内可溶性蛋白。
9.一种抗棘球蚴重组亚单位融合蛋白疫苗，其特征在于，包含CHO细胞株发酵纯化得到的rEG95-Fc融合蛋白和药学上可以接受的载体；所述CHO细胞株为保藏编号为CCTCC NO:C2022186的中国仓鼠卵巢细胞3F4-rEG95-Fc。
10.一种根据权利要求1所述的抗棘球蚴重组亚单位融合蛋白疫苗在制备预防和/或治疗棘球蚴感染的药物中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种抗棘球蚴重组亚单位融合蛋白疫苗，其特征在于，包含免疫原的reg95-fc融合蛋白和药学上可以接受的载体；其中，所述reg95-fc融合蛋白为氨基酸序列如seq id no.1所示的蛋白，或为如seq id no.1所示的氨基酸序列包括经过取代、缺失或添加一个氨基酸或几个氨基酸且具有免疫原性的衍生的蛋白。
2.根据权利要求1所述的抗棘球蚴重组亚单位融合蛋白疫苗，其特征在于，所述衍生的蛋白，其氨基酸序列如seq id no.2所示。
3.根据权利要求1所述的抗棘球蚴重组亚单位融合蛋白疫苗，其特征在于，所述reg95-fc融合蛋白含量为20-100μg/ml。
4.根据权利要求1所述的抗棘球蚴重组亚单位融合蛋白疫苗，其特征在于，所述药学上可以接受的载体包括佐剂，所述佐剂包括：(1)白油、铝胶佐剂、皂苷、阿夫立定、dda；(2)油包水乳剂、水包油乳剂、水包油包水乳剂；(3)丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物、顺丁烯二酸酐和链烯基衍生物的共聚物；以及ribi佐剂系统、blockco-polymer、saf-m、单磷酰脂质a、avridine脂质-胺佐剂、大肠杆菌不耐热肠毒素、霍乱毒素、ims1314、胞壁酰二肽、montanide isa 206、montanide isa 50v、gel佐剂中的一种或几种；所述抗棘球蚴重组亚单位融合蛋白疫苗中佐剂含量为5％-60％v/v。
5.根据权利要求1所述的抗棘球蚴重组亚单位融合蛋白疫苗，其特征在...
【专利技术属性】
技术研发人员：翟伟锋，殷波，王锋，张震，仲从浩，
申请(专利权)人：申联生物医药上海股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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