【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于松材线虫培养，具体涉及一种松材线虫同步化培养方法。
技术介绍
1、线虫由卵孵化出幼虫，幼虫发育为成虫后，大多数需通过两性交配后产卵，完成一个发育循环，即线虫的生活史。卵孵化出来的幼虫形态与成虫大致相似，所不同的是生殖系统尚未发育或未充分发育。幼虫发育到一定阶段就蜕皮一次，蜕去原来的角质膜而形成新的角质膜，蜕化后的幼虫大于原来的幼虫。每蜕化一次，线虫就增加一个龄期。线虫的幼虫—般有4个龄期。垫刃目线虫的第一龄幼虫是在卵内发育的，所以从卵内孵化出来的幼虫已是第二龄幼虫，经过最后一次的蜕化形成成虫，这时雌虫和雄虫在形态上已明显不同，生殖系统已充分发育，性器官容易观察。
2、松材线虫病(pine wilt disease)被称为松树的“癌症”，是全世界范围内松林的巨大威胁。
3、松材线虫属于线虫动物门、侧尾腺口纲、垫刃目、滑刃总科、伞滑刃亚科、伞滑刃线虫属。松材线虫体型微小，移动缓慢，需借助显微镜观察。在显微镜下，当松材线虫处于二龄到四龄阶段时，其幼虫尾部呈现不同的圆钝形，部分带尾尖突，此时雌雄虫还难以分辨。等到成虫时，根据雌虫尾端钝圆，雄虫尾部则形成尖端，呈勾刺状的形态特征，可快速准确区分出雌雄虫。不同龄期线虫体长差异和雌雄虫之间的形态学差异主要由遗传基因所决定。
4、松材线虫的生活周期包含两种类型，即繁殖型和扩散型线虫。繁殖型松材线虫包括卵、二龄(j2)、三龄(j3)、四龄(j4)及成虫。在25℃下，取食灰葡萄孢菌(botrytiscinerea)的松材线虫4-5天便可完成一代；30
5、专家学者们从生物学特性等各个方面对松材线虫病的致病机理展开探究，但迄今为止松材线虫病的致病机理仍不清楚。通过对松材线虫进行同步化，使研究人员可以精确获得任一龄期的松材线虫以对其进行更加针对性的精确研究。例如对各龄期松材线虫转录组进行分别测序，对比基因表达异质性，有助于构建松材线虫生长发育的基因时空表达图谱。其次松材线虫各龄期发育状况和生理情况不同，导致其对药物、信息素等分子物质的反应不同，并且不同龄期线虫对基因干扰、切除等遗传操作也有不同的反应。不同龄期松材线虫所分泌的信息素、效应因子以及共生微生物不同，这些物质在松材线虫致病力研究中也发挥着不同的作用。因此在松材线虫致病力研究中，松材线虫同步化是一种必不可少的技术手段。
6、秀丽隐杆线虫作为一种模式生物，对松材线虫各方面研究具有借鉴意义。秀丽隐杆线虫的同步化方法主要分为两种，产卵法和裂解法。产卵法是挑取处于产卵期的雌雄同体线虫成虫放在涂有大肠杆菌op50的ngm培养基上产卵，产卵结束后将成虫挑离培养基，同步培养以得到同步化秀丽隐杆线虫。裂解法是使用裂解液裂解产卵期线虫，使虫体破裂，卵留下，同步化培养获得同步化秀丽隐杆线虫。
7、松材线虫与秀丽隐杆线虫的一个极其显著的差异是并非雌雄一体，所以若是使用产卵法进行同步化需要区分性别进行挑取，耗时长，且费力；裂解法中所使用的裂解液无法确定其会对松材线虫产生怎样的影响。因此本专利技术避开这些复杂和不确定的因素，紧密利用松材线虫的生活史周期来进行同步化。
技术实现思路
1、本专利技术所要解决的技术问题在于针对上述现有技术的不足，提供一种松材线虫同步化培养方法，该方法操作简单，紧密利用松材线虫的生活史周期来进行同步化。
2、为解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案是：一种松材线虫同步化培养方法，该方法为：
3、s1、配制pda固体培养基，在温度为121℃、压力为0.12mpa的条件下灭菌15min后，制备两种规格的平板，供后续使用；
4、s2、真菌培养：用打孔器从培养灰葡萄孢botrytis cinerea的原真菌平板上打孔，将菌饼转移至s1中得到的平板上，在温度为25℃的条件下，黑暗培养6天～8天，得到真菌平板；
5、s3、松材线虫培养：将100μl的松材线虫悬液滴加于s2中得到的真菌平板的中心，在温度为25℃的条件下，黑暗培养4天～5天，得到松材线虫取食后的平板；
6、s4、贝尔曼漏斗法收集线虫：在口径为9cm的漏斗末端接一段橡皮管，在所述橡皮管后端用弹簧夹夹紧，将连接后漏斗放置于铁架上，在所述漏斗中先放置双层滤纸，用蒸馏水浸润后，在所述双层滤纸上层4层卫生纸，得到处理后的漏斗；
7、将s3中得到的松材线虫取食后的平板等分切割为四部分，放进处理后的漏斗中，加蒸馏水至浸没培养基，在温度为25℃的条件下分离12h～24h后，打开弹簧夹，收集得到松材线虫液；
8、s5、线虫清洗：将s4中得到的松材线虫液离心后，弃上清液，然后加入向剩余的沉淀物质中加无菌ddh2o，离心后，弃上清液，然后再向剩余的沉淀物质加入无菌ddh2o，离心后，弃上清液，然后再向剩余的沉淀物质加入无菌ddh2o，得到清洗后的松材线虫液；
9、s6、松材线虫虫卵分离：将s5中得到的清洗后的松材线虫液转移至干净的玻璃培养皿中，静置1h～2h，松材线虫卵黏附在所述玻璃培养皿表面，其他不同龄期的线虫悬浮在液体中，用移液枪将液体吸出，并用无菌ddh2o冲洗直至所述玻璃培养皿上只剩下卵，无其他龄期线虫，得到松材线虫虫卵；
10、s7、l2幼虫培养：向s6中松材线虫虫卵中加入蒸馏水，在温度为25℃的培养箱中培养24h～30h，得到l2幼虫悬液；
11、s8、l3龄幼虫：将s7中得到的l2幼虫悬液滴于s2中得到的真菌平板的中心，在温度为25℃的培养箱中培养24h～30h，得到l3幼虫；
12、s9、l4龄幼虫：将s7中得到的l2幼虫悬液滴于s2中得到的真菌平板的中心，在温度为25℃的培养箱中培养48h～54h，得到l4幼虫；
13、s10、成虫：将s7中得到的l2幼虫悬液滴于s2中得到的真菌平板的中心，在温度为25℃的培养箱中培养72h～78h，得到成虫。
14、优选地，s2中所述打孔器的孔径为5mm～5.5mm。
15、优选地，用于s3中所用的所述真菌平板的规格是100mm(直径)×20mm(高)，s8～s10中所用的所述真菌平板的规格是60mm(直径)×15mm(高)。
16、优选地，s3中所述松材线虫悬液的制备方法为贝尔曼漏斗法；所述松材线虫悬液中松材线虫的数量约为3000头。
17、优选地，s5中离心的转速为9000rpm，离心的时间为2min。
18、本专利技术与现有技术相比具有以下优点：
19、1、本专利技术操作简单方便，要求低。实验过程中的操作不涉及高难度的技术要点，为最基本的松材线虫饲养方法，极易掌握，对实验人员要求低。
20、2、本专利技术培养方法简单本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种松材线虫同步化培养方法，其特征在于，该方法为：
2.根据权利要求1所述的一种松材线虫同步化培养方法，其特征在于，S2中所述打孔器的孔径为5mm～5.5mm。
3.根据权利要求1所述的一种松材线虫同步化培养方法，其特征在于，用于S3中所用的所述真菌平板的规格是100mm×20mm，S8～S10中所用的所述真菌平板的规格是60mm×15mm。
4.根据权利要求1所述的一种松材线虫同步化培养方法，其特征在于，S3中所述松材线虫悬液的制备方法为贝尔曼漏斗法。
5.根据权利要求1所述的一种松材线虫同步化培养方法，其特征在于，S5中离心的转速为9000rpm，离心的时间为2min。
【技术特征摘要】
1.一种松材线虫同步化培养方法，其特征在于，该方法为：
2.根据权利要求1所述的一种松材线虫同步化培养方法，其特征在于，s2中所述打孔器的孔径为5mm～5.5mm。
3.根据权利要求1所述的一种松材线虫同步化培养方法，其特征在于，用于s3中所用的所述真菌平板的规格是100mm×20mm，s8...
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