【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及气生藻分离纯化，具体涉及一种气生叶附生藻类的分离纯化方法。
技术介绍
1、藻类作为自然界中重要的初级生产者，广泛存在于各种各样的生态环境中，相对于水生环境，气生藻类的生长环境更加复杂多样，对气生藻类的研究也相对薄弱。在湿热的热带雨林地区，高等植物叶片表面经常有气生藻类附着，研究表明这些气生叶附生藻类有着独特的生存策略和极高的多样性。然而，随着全球气候变化加剧、自然资源过度开发、人类活动影响程度不断加深，很多热带雨林中的物种还未被发现就逐渐灭亡，气生叶附生藻类由于其形体微小、形态结构简单，在热带雨林的保护工作中往往被忽视。气生叶附生藻类的分类学、生态、生理学研究，揭示其生活史策略、分子多样性、生态系统功能等，对气生藻类的资源化利用、热带雨林生态系统功能的全面认识和保护等方面都具有很重要的经济和生态价值。
2、现有研究涉及到的藻类分离纯化方法，大多都是针对水生藻类提出的，主要有：培养基筛选法、稀释分离法、毛细管分离法、小滴分离法、ph分离法、温度分离法等，这些方法在分离纯化水生藻类方面有一定的适用性，其中毛细管分离法效果最佳、应用最多。然而，现有的这些分离纯化方法并不适用与气生叶附生藻类，由于气生叶附生藻类特殊的生长环境，其群落往往夹杂着多种气生真菌、细菌、小型昆虫及虫卵、大气沉降的灰尘等固体颗粒等杂质，形成了一个错综复杂、相互缠绕或嵌入的复杂微生态系统，细胞形态往往也发生一些不规则的变化，从而形成紧密干燥的不规则黏贴或聚集，再加上气生藻类随空气传播能力强、容易造成二次污染，导致水生藻类分离纯化方法在处理气
技术实现思路
1、为了解决上述技术问题，本专利技术的目的是提供一种气生叶附生藻类的分离纯化方法，以解决现有技术中气生藻类时分离纯化效果差的问题。
2、本专利技术解决上述技术问题的技术方案如下：提供一种气生叶附生藻类的分离纯化方法，依次包括以下步骤：
3、(1)在采集的高等植物叶片上选择3-5个点，在每个点刮取藻落，加入蒸馏水中，室温放置超过2h，震荡30-60s，得到悬浮藻液；
4、(2)将步骤(1)制得的悬浮藻液稀释后，涂布到bg11固体培养基平板上，然后室内培养15-20d，直至平板上出现肉眼可见的单藻落；
5、(3)将步骤(2)得到的单藻落按照每间隔一个孔接种一次的方式，接种到加入bg11液体培养基的96孔板中，然后室内培养10-20d，直至每个孔中的藻长到肉眼可见的绿色；
6、(4)将步骤(3)得到的每个孔中的藻液转移至加入bg11液体培养基的12孔板中，然后室内培养10-20d，直至每个孔中的藻长到绿色，每一个孔内即为一株分离纯化的藻株。
7、在上述技术方案的基础上，本专利技术还可以做如下改进：
8、进一步，步骤(1)中，采用无菌镊子在每个点刮取藻落。
9、进一步，步骤(1)中，加入有蒸馏水的离心管中。
10、进一步，步骤(1)中，采用旋涡振荡器震荡30-60s。
11、进一步，步骤(2)中，稀释后藻液浓度为500-1000cells/ml。
12、进一步，步骤(2)中，于15-25℃和光暗比12：12条件下室内培养。
13、进一步，采用光照培养箱进行室内培养。
14、进一步，步骤(3)中，在解剖镜下寻找单藻落，用灭菌过的接种针挑取单藻落，进行接种。
15、进一步，步骤(3)中，bg11液体培养基的体积为96孔板孔容积的2/3。
16、进一步，步骤(3)中，于15-25℃和光暗比12：12条件下室内培养。
17、进一步，采用光照培养箱进行室内培养。
18、进一步，步骤(4)中，bg11液体培养基的体积为12孔板孔容积的2/3。
19、进一步，步骤(4)中，于15-25℃和光暗比12：12条件下室内培养。
20、进一步，采用光照培养箱进行室内培养。
21、进一步，步骤(4)中，按照每间隔一个孔接种一次的方式，将步骤(3)得到的每个孔中的藻液转移至加入bg11液体培养基的12孔板中。
22、本专利技术具有以下有益效果：
23、1、由于气生叶附生藻类特殊的生长环境，其群落往往夹杂着多种气生真菌、细菌、小型昆虫及虫卵、大气沉降的灰尘等固体颗粒等杂质，形成了一个错综复杂、相互缠绕或嵌入的复杂微生态系统，细胞形态往往也发生一些不规则的变化，从而形成紧密干燥的不规则黏贴或聚集，通过在蒸馏水中浸泡，然后震荡，使聚集成团的气生藻类群落均匀散开，在水中形成均匀的悬浮藻液，能够得到单一物种的纯培养藻种。
24、2、由于大部分单细胞的气生藻类细胞大小在10μm左右，甚至更小。现有的毛细管分离法在分离这么微小的藻细胞时，难度极大，成功率极低，非常难使用。而平板涂布的方法可以有效避免该问题，同时可以批量接种，提高分离效率。
25、3、在96孔板或12孔板中进行隔孔接种，然后进行传代培养和扩大培养，极大节约了藻种培养所需的空间，同时也能够有效避免气生藻类易污染的问题。获得单藻落之后，如果每一株藻都单独使用培养皿或者三角瓶进行培养，需要很大的实验场地。而选用96孔板或12孔板，可以显著减少实验空间的需求，极大的节约空间。同时，由于96孔板和12孔板的巧妙设计，每一个接种孔都是独立空间，可以有效避免气生藻落易传播、易污染的问题，而且隔孔接种更进一步保障了不同藻株之间不会出现交叉污染。此外，经过12孔板的扩大培养之后，获得的藻液和生物量足以满足镜检、dna提取等藻种的鉴定和保种需要，经济适用、避免不必要的浪费。
26、4、本专利技术提出的方法有效解决了气生叶附生藻类分离纯化的关键问题，包括：通过蒸馏水中浸泡、震荡，使聚集成团的气生藻类群落均匀散开，在水中形成均匀的悬浮藻液，解决了气生叶附生藻类群落成分复杂、聚集成团而引起的藻细胞分离困难的问题；使用平板涂布的方法，对悬浮藻液中的藻类细胞进行分离，可以批量操作、提高工作效率，并有效避免了现有的毛细管分离法的不适用问题；在96孔板或12孔板中进行隔孔接种和培养，极大节约了藻种培养所需的空间，同时也有效避免了气生藻类易污染的问题。这是一种高效便捷的气生叶附生藻类的分离纯化方法，能为未来气生叶附生藻类生理生态学研究和气生叶附生藻类的分离纯化与培养提供技术支撑，采用本专利技术的方法能够批量操作分离纯化气生叶附生藻类，简单、便捷、经济、高效。
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1.一种气生叶附生藻类的分离纯化方法，其特征在于，依次包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的气生叶附生藻类的分离纯化方法，其特征在于，步骤(1)中，采用无菌镊子在每个点刮取藻落。
3.根据权利要求1所述的气生叶附生藻类的分离纯化方法，其特征在于，步骤(1)中，加入有蒸馏水的离心管中。
4.根据权利要求1所述的气生叶附生藻类的分离纯化方法，其特征在于，步骤(2)中，稀释后藻液浓度为500-1000cells/mL。
5.根据权利要求1所述的气生叶附生藻类的分离纯化方法，其特征在于，步骤(2)中，于15-25℃和光暗比12：12条件下室内培养。
6.根据权利要求1所述的气生叶附生藻类的分离纯化方法，其特征在于，步骤(3)中，在解剖镜下寻找单藻落，用灭菌过的接种针挑取单藻落，进行接种。
7.根据权利要求1所述的气生叶附生藻类的分离纯化方法，其特征在于，步骤(3)中，BG11液体培养基的体积为96孔板孔容积的2/3。
8.根据权利要求1所述的气生叶附生藻类的分离纯化方法，其特征在于，步骤(3)中，于15
9.根据权利要求1所述的气生叶附生藻类的分离纯化方法，其特征在于，步骤(4)中，BG11液体培养基的体积为12孔板孔容积的2/3。
10.根据权利要求1所述的气生叶附生藻类的分离纯化方法，其特征在于，步骤(4)中，于15-25℃和光暗比12：12条件下室内培养。
...【技术特征摘要】
1.一种气生叶附生藻类的分离纯化方法，其特征在于，依次包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的气生叶附生藻类的分离纯化方法，其特征在于，步骤(1)中，采用无菌镊子在每个点刮取藻落。
3.根据权利要求1所述的气生叶附生藻类的分离纯化方法，其特征在于，步骤(1)中，加入有蒸馏水的离心管中。
4.根据权利要求1所述的气生叶附生藻类的分离纯化方法，其特征在于，步骤(2)中，稀释后藻液浓度为500-1000cells/ml。
5.根据权利要求1所述的气生叶附生藻类的分离纯化方法，其特征在于，步骤(2)中，于15-25℃和光暗比12：12条件下室内培养。
6.根据权利要求1所述的气生叶附生藻类的分离纯化方法...
【专利技术属性】
技术研发人员：李书印，郭文思，夏一丹，段必辉，许元钊，肖鹏，李天翠，赵培双，龚斌，普中勇，简云忠，杨关发，苏武华，
申请(专利权)人：生态环境部长江流域生态环境监督管理局生态环境监测与科学研究中心，
类型：发明
国别省市：
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