【技术实现步骤摘要】
本申请涉及构建甘草悬浮培养体系的，更具体地说，它涉及一种快速建立甘草细胞悬浮培养体系的方法。
技术介绍
1、目前甘草内可用于药用的次生代谢物质主要为黄酮类化合物、三萜皂苷和甘草酸，这三类物质在食品、化妆品和医药领域具有很高的药用价值。因此市场对甘草的需求日益增加，但种植资源有限，不能满足市场需求。
2、因此，现有技术大多采用组织培养技术，通过快速繁殖的方法获取甘草资源；另外一种方法是在培养基内添加植物生长调节剂，利用甘草外植体诱导出愈伤组织，再用松散、生长状态较好的愈伤组织建立细胞悬浮培养体系，通过采用甘草细胞大规模培养的方式生产甘草黄酮。
3、该体系虽然已经较为成熟，但从愈伤组织诱导、增殖继代培养到细胞悬浮震荡培养所耗费的时间较长，并且长期以来在该技术基础上没有突破性的进展。因此，建立稳定、高效的甘草细胞悬浮体系，短时间使其达到工业化生产标准是较为迫切的。
技术实现思路
1、为了缩短甘草细胞悬浮培养的培养周期，本申请提供一种快速建立甘草细胞悬浮培养体系的方法。
2、本申请提供的一种快速建立甘草细胞悬浮培养体系的方法采用如下的技术方案：
3、一种快速建立甘草细胞悬浮培养体系的方法，包括以下步骤：
4、将切割后的甘草外植体接种至液体培养基上，黑暗条件下培养20-40天；
5、所述液体培养基的组分包括：ms培养基、6-ba0.3-1.5mg/l、naa0.3-1.5mg/l、2,4-d 0.3-1.5mg/l和碳源
6、通过采用上述技术方案，本申请的方法是在现有的组织培养及细胞悬浮培养技术的基础上，省略甘草愈伤组织诱导和传代增殖培养的步骤，直接将甘草外植体置于液体培养中悬浮震荡培养，获取细胞培养液，该细胞内含有目标代谢产物(例如甘草总黄酮、光甘草定)。该方法能够在短时间内获得稳定的甘草细胞悬浮液，且目标代谢产物甘草总黄酮的含量较高，能够达到高效、稳定工业化生产甘草黄酮的目的。
7、本申请中，6-ba指的是植物激素6-苄氨基嘌呤，naa指的是植物激素萘乙酸，2,4-d指的是一种植物生长调节剂2,4-二氯苯氧乙酸。
8、在一些实施方案中，所述液体培养基中6-ba的含量可以为0.3-0.6mg/l、0.6-0.9mg/l、0.9-1.2mg/l或1.2-1.5mg/l。
9、在一个实施例中，所述液体培养基中6-ba的含量可以为0.3mg/l、0.45mg/l、0.58mg/l、0.62mg/l、0.74mg/l、0.85mg/l、0.97mg/l、1.09mg/l、1.24mg/l、1.38mg/l或1.49mg/l。
10、在一些实施方案中，所述液体培养基中naa的含量可以为0.3-0.6mg/l、0.6-0.9mg/l、0.9-1.2mg/l或1.2-1.5mg/l。
11、在一个实施例中，所述液体培养基中naa的含量可以为0.3mg/l、0.45mg/l、0.58mg/l、0.62mg/l、0.74mg/l、0.85mg/l、0.97mg/l、1.09mg/l、1.24mg/l、1.38mg/l或1.49mg/l。
12、在一些实施方案中，所述液体培养基中2,4-d的含量可以为0.3-0.6mg/l、0.6-0.9mg/l、0.9-1.2mg/l或1.2-1.5mg/l。
13、在一个实施例中，所述液体培养基中2,4-d的含量可以为0.3mg/l、0.45mg/l、0.58mg/l、0.62mg/l、0.74mg/l、0.85mg/l、0.97mg/l、1.09mg/l、1.24mg/l、1.38mg/l或1.49mg/l。
14、可选的，所述液体培养基的组分包括：ms培养基、6-ba 0.5mg/l、naa0.5mg/l、2,4-d 0.5mg/l和碳源30g/l；或者所述液体培养基的组分包括：ms培养基、6-ba0.5mg/l、naa1.5mg/l、2,4-d 1.5mg/l和碳源30g/l。
15、通过采用上述技术方案，以上述方案能够获得总黄酮含量更高的甘草细胞。
16、可选的，黑暗条件下培养时伴随震荡，震荡转速为100-200rpm。
17、在一些实施方案中，所述震荡转速为100-125rpm、125-149rpm、145-162rpm、160-185rpm或180-200rpm。
18、在一些实施例中，所述震荡转速为100rpm、113rpm、136rpm、155rpm或190rpm。
19、通过采用上述技术方案，充分的震荡搅拌有利于物质传输，使得甘草细胞生长状况良好。
20、可选的，黑暗条件下培养时的温度为22-28℃。
21、可选的，切割后的甘草外植体接种至液体培养基时，接种量为0.005-0.015g外植体/ml液体培养基。
22、在一些实施方案中，所述接种量为0.005-0.008g外植体/ml液体培养基、0.008-0.011g外植体/ml液体培养基或0.011-0.015g外植体/ml液体培养基。
23、在一些实施例中，所述接种量为0.005g外植体/ml液体培养基、0.007g外植体/ml液体培养基、0.005g外植体/ml液体培养基、0.007g外植体/ml液体培养基、0.009g外植体/ml液体培养基、0.010g外植体/ml液体培养基、0.012g外植体/ml液体培养基或0.015g外植体/ml液体培养基。
24、可选的，所述外植体选自甘草根、甘草茎、甘草叶、甘草胚根、甘草胚轴以及甘草子叶中的至少一种。
25、进一步可选的，所述外植体为甘草根。甘草根为外植体获得的甘草细胞，其总黄酮含量更高。
26、可选的，所述液体培养基的ph为5.8-6.0。
27、可选的，所述碳源选自蔗糖和葡萄糖中的任意一种。
28、可选的，黑暗条件下培养20-40天的处理具体包括以下步骤：
29、将接种至液体培养基上的甘草外植体黑暗条件下培养15-20天，随后加入棉子酚0.5-1.5mg/l并微波处理10-15s，随后继续黑暗条件下继续培养5-20天。
30、通过采用上述技术方案，以棉子酚和微波协作处理培养一段时间的细胞后，通过外界刺激使得甘草细胞做出应激反应，以刺激细胞的代谢途径，能够显著促进甘草细胞合成黄酮。微波刺激和棉子酚本身是一种外界刺激，二者协作下甘草细胞针对该外界刺激做出应激反应，能够显著促进黄酮合成；而微波刺激又能进一步改变细胞通透性，使得棉子酚更易进入细胞以发挥作用。此外，棉子酚具有多羟基结构，具有还原性，进一步又能够避免严重的细胞损伤导致细胞培养的生物量减少；短时间的微波处理也是为了避免严重的细胞损伤导致细胞培养的生物量减少。
31、在一些实施方案中，所述棉子酚的添加量可以为0.5-0.6mg/l、本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种快速建立甘草细胞悬浮培养体系的方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种快速建立甘草细胞悬浮培养体系的方法，其特征在于，所述液体培养基的组分包括：MS培养基、6-BA 0.5mg/L、NAA 0.5mg/L、2,4-D 0.5mg/L和碳源30g/L；或者所述液体培养基的组分包括：MS培养基、6-BA 0.5mg/L、NAA 1.5mg/L、2,4-D1.5mg/L和碳源30g/L。
3.根据权利要求1所述的一种快速建立甘草细胞悬浮培养体系的方法，其特征在于，黑暗条件下培养时伴随震荡，震荡转速为100-200rpm。
4.根据权利要求1所述的一种快速建立甘草细胞悬浮培养体系的方法，其特征在于，黑暗条件下培养时的温度为22-28℃。
5.根据权利要求1所述的一种快速建立甘草细胞悬浮培养体系的方法，其特征在于，切割后的甘草外植体接种至液体培养基时，接种量为0.005-0.015g外植体/mL液体培养基。
6.根据权利要求1所述的一种快速建立甘草细胞悬浮培养体系的方法，其特征在于，所述外植体选自甘草
7.根据权利要求1所述的一种快速建立甘草细胞悬浮培养体系的方法，其特征在于，所述液体培养基的pH为5.8-6.0。
8.根据权利要求1所述的一种快速建立甘草细胞悬浮培养体系的方法，其特征在于，所述碳源选自蔗糖和葡萄糖中的任意一种。
9.根据权利要求1所述的一种快速建立甘草细胞悬浮培养体系的方法，其特征在于，黑暗条件下培养20-40天的处理具体包括以下步骤：
10.根据权利要求9所述的一种快速建立甘草细胞悬浮培养体系的方法，其特征在于，微波处理的温度为30-40℃，微波处理的功率为200-300w。
...【技术特征摘要】
1.一种快速建立甘草细胞悬浮培养体系的方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种快速建立甘草细胞悬浮培养体系的方法，其特征在于，所述液体培养基的组分包括：ms培养基、6-ba 0.5mg/l、naa 0.5mg/l、2,4-d 0.5mg/l和碳源30g/l；或者所述液体培养基的组分包括：ms培养基、6-ba 0.5mg/l、naa 1.5mg/l、2,4-d1.5mg/l和碳源30g/l。
3.根据权利要求1所述的一种快速建立甘草细胞悬浮培养体系的方法，其特征在于，黑暗条件下培养时伴随震荡，震荡转速为100-200rpm。
4.根据权利要求1所述的一种快速建立甘草细胞悬浮培养体系的方法，其特征在于，黑暗条件下培养时的温度为22-28℃。
5.根据权利要求1所述的一种快速建立甘草细胞悬浮培养体系的方法，其特征在于，切割后的甘草外...
【专利技术属性】
技术研发人员：位明君，毛奎静，赵永军，潘如雪，邵瞳，叶江成，孙永灿，
申请(专利权)人：浙江觅得优生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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