【技术实现步骤摘要】
本专利技术总体上涉及免疫学领域。具体地，本专利技术涉及特异性结合kras_g12v突变抗原的t细胞受体(下文中也缩写为tcr)、表达所述tcr的基因工程化细胞、以及制备所述基因工程化细胞的方法。本专利技术还涉及将外源性cd8分子与所述tcr基因共表达于t细胞以增强t细胞的功能。本专利技术提供了所述tcr和所述基因工程化细胞在检测、预防和/或治疗kras_g12v突变抗原相关的癌症中的用途。
技术介绍
1、ras基因是第一个被发现的人类肿瘤基因(oncogene)，其编码的ras蛋白在许多重要的细胞信号网络上处于中心位置。ras基因是人类癌症中最常出现突变的致癌基因。目前已经在所有人类肿瘤的大约1/5中发现了ras基因突变引起的ras蛋白激活。
2、kras基因(kirsten大鼠肉瘤病毒癌基因同源物)编码的kras蛋白是一种小gtp酶，属于ras超蛋白家族。
3、在细胞内，kras蛋白在失活和激活状态之间转变，其中当kras蛋白与鸟嘌呤核苷二磷酸(gdp)结合时，kras蛋白处于失活状态；当kras蛋白与鸟嘌呤核苷三磷酸(gtp)结合时，kras蛋白处于激活状态，并且可以激活下游信号通路。大部分细胞中的kras蛋白处于失活状态。
4、在kras基因的突变中，97％是第12号或者第13号氨基酸残基发生了突变。其中一种主要的突变是g12v。结构学研究表明。当kras发生g12v突变后，会通过破坏gap活性而使kras蛋白一直保持与gtp结合，将kras蛋白锁定在具有酪氨酸激酶活性状态，并不断激活下
5、在人类癌症中，kras基因为肿瘤学领域最著名的致癌基因之一，曾被认为是“不可成药(undruggable)”的靶点。kras基因突变出现在接近90％的胰腺癌中，30-40％的结肠癌中，17％的子宫内膜癌中，15-20％的肺癌(包括小叶性肺癌)中，以及胆管癌、宫颈癌、膀胱癌等。
6、近年来，针对kras突变体，研究开发了共价抑制剂，其通过变构位点靶向kras突变体，使得kras突变体与gtp的亲和力降低而达到“锁死”kras突变体活性的目的。例如，安进公司的用于治疗携带kras_g12c突变的非小细胞肺癌(nsclc)患者的sotorasib(amg510)，为kras_g12c抑制剂；miratitherapeutics公司的mrtx1257，也为一种kras_g12c抑制剂，目前处于临床前开发阶段。
7、针对其他kras突变，例如，kras_g12v突变目前尚无相关治疗性药物。本领域需要开发出针对kras_g12v突变抗原的特异性免疫细胞，例如，tcr-t细胞，来有效检测、预防和治疗kras_g12v突变抗原相关的癌症。
技术实现思路
1、本专利技术人通过锐意研究，获得了能与kras_g12v突变抗原特异性结合的t细胞受体(tcr)，并制备了重组表达该tcr的淋巴细胞，由此，能够通过tcr与kras_g12v突变抗原特异性结合来检测哺乳动物中kras_g12v突变抗原相关的癌症存在；和/或能够通过体内介导针对表达kras_g12v突变抗原的靶细胞的免疫应答来杀伤表达kras_g12v突变抗原的癌细胞，从而满足了上述需求。
2、因此，在一个方面，本专利技术提供了分离的或纯化的t细胞受体(tcr)，其与kras_g12v突变抗原特异性结合，优选地，所述tcr包含α链和β链，其中所述α链和β链各包含三个互补决定区(cdr)，并且α链的cdr3的氨基酸序列选自seq id no:3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、33、36、39、42、45、48和与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体，β链的cdr3的氨基酸序列选自seq id no:179、182、185、188、191、194、197、200、203、206、209、212、215、218、221、224和与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体。
3、在一个实施方案中，本专利技术的tcrα链的cdr3的氨基酸序列和β链的cdr3的氨基酸序列是：
4、(i)seq id no:3所示的α链cdr3氨基酸序列或与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及seq id no:179所示的β链cdr3氨基酸序列或与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；
5、(ii)seq id no:6所示的α链cdr3氨基酸序列或与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及seq id no:182所示的β链cdr3氨基酸序列或与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；
6、(iii)seq id no:9所示的α链cdr3氨基酸序列或与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及seq id no:185所示的β链cdr3氨基酸序列或与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；
7、(iv)seq id no:12所示的α链cdr3氨基酸序列或与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及seq id no:188所示的β链cdr3氨基酸序列或与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；
8、(v)seq id no:15所示的α链cdr3氨基酸序列或与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及seq id no:191所示的β链cdr3氨基酸序列或与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；
9、(vi)seq id no:18所示的α链cdr3氨基酸序列或与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及seq id no:194所示的β链cdr3氨基酸序列或与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；
10、(vii)seq id no:21所示的α链cdr3氨基酸序列或与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及seq id no:197所示的β链cdr3氨基酸序列或与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；
11、(viii)seq id no:24所示的α链cdr3氨基酸序列或与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及seq id no:200所示的β链cdr3氨基酸序列或与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；
12、(ix)seq id no:27所示的α链cdr3氨基酸序列或与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及seq id no:203所示的β链cdr3氨基酸序列或与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；
13、(x)seq id no:30所示的α链cdr3氨基酸序列或与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体；以及seq id no:206所示的β链cdr3氨基酸序列或与所述序列具有1个或2个氨基酸残基本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.分离的或纯化的T细胞受体，所述T细胞受体也简称为TCR，其特征在于，与KRAS_G12V突变抗原特异性结合，所述TCR包含α链和β链，其中所述α链和β链各包含三个互补决定区，所述互补决定区也简称为CDR，并且α链的CDR3的氨基酸序列选自SEQ ID NO:3、9、12、15、18、21、24、27、30、33、36、39、42、45、48和与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体，β链的CDR3的氨基酸序列选自SEQ ID NO:179、185、188、191、194、197、200、203、206、209、212、215、218、221、224和与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体。
2.根据权利要求1所述的TCR，其中，所述α链的CDR3的氨基酸序列和β链的CDR3的氨基酸序列是：
3.根据权利要求2所述的TCR，其中，所述α链包含的三个CDR的氨基酸序列和β链包含的三个CDR的氨基酸序列是：
4.根据权利要求1至3中任一项所述的TCR，其中，所述TCR还包含恒定区，例如，所述恒定区是小鼠恒定区；
5.核酸分子
6.载体，其特征在于，包含权利要求5所述的核酸分子，所述载体优选地为质粒、穿梭质粒、噬菌粒、粘粒、表达载体；更优选地为同源重组修复(HDR)载体或病毒载体，例如，慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒(AAV)载体、疱疹病毒载体、逆转录病毒载体、杆状病毒载体。
7.T细胞受体融合蛋白或T细胞受体缀合物，其包含权利要求1－4中任一项所述的TCR和其他生物活性分子，其中所述其他生物活性分子是例如抗体、细胞因子、细胞毒性剂、酶、放射性物质、可检测标记，其中所述TCR和其他生物活性分子之间具有或不具有接头。
8.一种工程化细胞，其特征在于，表达权利要求1－4中任一项所述的TCR，优选地，所述工程化细胞是工程化的T细胞、工程化的NK细胞；或者所述工程化细胞是工程化的干细胞，例如，所述工程化细胞是工程化的人CD4+T细胞或工程化的人CD8+T细胞，或者是工程化的人CD4+T细胞和工程化的人CD8+T细胞的混合细胞群；或者，所述工程化细胞是工程化的造血干细胞。
9.一种工程化的人CD4+T细胞和/或工程化的人CD8+T细胞，其特征在于，表达权利要求1－4中任一项所述的TCR并表达外源CD8a或者CD8ab。
10.产生权利要求9所述的T细胞的方法，所述方法包括用外源CD8a或者CD8ab；以及权利要求1－4中任一项所述的TCR转染CD4+T细胞和/或CD8+T细胞的步骤，例如，所述外源CD8a或者CD8ab以及权利要求1－4中任一项所述的TCR在所述CD4+T细胞和/或CD8+T细胞中从相同载体表达，例如，其中表达所述外源CD8a或者CD8ab的构建体以及表达权利要求1－4中任一项所述TCR的构建体被2A元件或IRES元件分开。
11.药物组合物，其特征在于，包含权利要求8所述的工程化细胞和/或权利要求9所述的工程化的人CD4+T细胞和/或工程化的人CD8+T细胞。
12.根据权利要求11的药物组合物的用途，其特征在于，用于制备治疗具有KRAS_G12V突变的疾病(例如，肿瘤)的药物。
...【技术特征摘要】
1.分离的或纯化的t细胞受体，所述t细胞受体也简称为tcr，其特征在于，与kras_g12v突变抗原特异性结合，所述tcr包含α链和β链，其中所述α链和β链各包含三个互补决定区，所述互补决定区也简称为cdr，并且α链的cdr3的氨基酸序列选自seq id no:3、9、12、15、18、21、24、27、30、33、36、39、42、45、48和与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体，β链的cdr3的氨基酸序列选自seq id no:179、185、188、191、194、197、200、203、206、209、212、215、218、221、224和与所述序列具有1个或2个氨基酸残基改变的变体。
2.根据权利要求1所述的tcr，其中，所述α链的cdr3的氨基酸序列和β链的cdr3的氨基酸序列是：
3.根据权利要求2所述的tcr，其中，所述α链包含的三个cdr的氨基酸序列和β链包含的三个cdr的氨基酸序列是：
4.根据权利要求1至3中任一项所述的tcr，其中，所述tcr还包含恒定区，例如，所述恒定区是小鼠恒定区；
5.核酸分子，其特征在于，编码权利要求1－4中任一项所述的tcr，优选地，所述核酸分子是密码子优化的、编码权利要求1－4中任一项所述的tcr的核苷酸序列。
6.载体，其特征在于，包含权利要求5所述的核酸分子，所述载体优选地为质粒、穿梭质粒、噬菌粒、粘粒、表达载体；更优选地为同源重组修复(hdr)载体或病毒载体，例如，慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒(aav)载体、疱疹病毒载体、逆转录病毒载体、杆状病毒载体。
7.t细胞受体融合蛋白或t细胞受体缀合物...
【专利技术属性】
技术研发人员：彭松明，安多，钟山，
申请(专利权)人：新景智源生物科技苏州有限公司，
类型：发明
国别省市：
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