【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及疫苗，具体涉及一种百日咳毒素脱毒方法及无细胞百白破联合疫苗。
技术介绍
1、百日咳是由百日咳杆菌引起的一种急性呼吸道传染病，主要发生在婴幼儿中。百日咳疫苗的免疫接种是预防百日咳的有效手段。
2、第一代疫苗，即从百日咳菌培养物的上清中纯化出含各种蛋白抗原而制备的疫苗，其中以丝状血凝素（fha）、pt为主, 含有少量agg。pt具有促淋巴细胞增多，激活胰岛细胞、组胺致敏等一系列生物学活性，是百日咳菌的主要毒力因子和保护性抗原，并只存在于百日咳菌中，须经化学或基因工程方法脱毒后才能作为疫苗成分。fha是一种无毒的大分子多肽，与百日咳菌在上呼吸道纤毛细胞的粘附有关。经小鼠脑内攻击自动免疫和气雾攻击被动免疫均证实, pt、fha是保护性抗原。这一代apv是含共纯化(co-purified) 各种蛋白抗原的混合物，不能人为控制各种抗原的比例，不同厂家、疫苗批间差异较大。
3、第二代疫苗是将各种抗原分别纯化后单独或混合而制备的疫苗，其中主要含pt、fha、69kd蛋白( prn )、菌毛蛋白( fim，又称agg)。prn和fim均与百日咳菌对呼吸道纤毛细胞的吸附有关，是保护性抗原。目前国内外开发的apv均是以pt为基础而组分各异的无细胞百白破(dtpa)三联疫苗。
4、第三代疫苗，即通过基因工程的方法获得单一或多种抗原成分，以确定的最适比例配比制备的apv。
5、pt是百日咳杆菌致病的主要毒力因子，同时也是其所产生的诸多生物活性物质中唯一不受争议的保护性抗原，百日咳杆菌是唯一能产
6、由于pt的毒性可引起多种生物学反应，必须对其进行脱毒处理后才可用于组分百白破疫苗制备，目前pt脱毒的方式主要为化学脱毒和遗传脱毒。pt化学脱毒所采用的脱毒剂主要有甲醛、戊二醛、过氧化氢等。pt作为疫苗的有效组分，理论上脱毒后应失去毒性并保留良好的免疫原性。oh h，et al.（characterization of the carbohydrate bindingand adp-ribosyltransferase activities of chemically detoxified pertussistoxins.vaccine，2013，31(29):2988-2993）发现甲醛脱毒的pt丧失了大部分生化活性，但在2 ~3周内其生化活性便恢复至与天然pt相当的水平，易发生毒性逆转。戊二醛可使pt的糖类结合活性完全失去作用且不可逆，但并不能灭活pt的adp-核糖基转移酶的活性。采用过氧化氢脱毒、edta、金属盐、硫酸铵共同脱毒，脱毒反应速率取决于过氧化氢、edta和金属盐。该方法脱毒过程中edta还会与金属盐螯合，反应复杂不易控制；同时由于缺乏抗聚集剂，在脱毒过程中蛋白质由于疏水作用聚集沉淀而不易除菌过滤，产量低，不适合大规模工业化生产。
7、脱毒条件对pt进行处理后，毒性和免疫原性也有很大的差异。yuen ct ,et al.（effect of different detoxification procedures on the residual pertussistoxin activities in vaccines. vaccine, 2016, 34(18): 2129-2134）同时开展了3组实验,分别对戊二醛脱毒、甲醛脱毒、先戊二醛脱毒再用甲醛脱毒pt的各种特性进行考察。其中采用戊二醛脱毒的pt保留adp-核糖基转移酶活性最高，其产生结合抗体水平以及导致小鼠组胺致敏活性也最高；先用戊二醛再结合甲醛实验组的adp-核糖基转移酶活性、结合抗体水平以及小鼠组胺致敏的活性次之，甲醛脱毒实验组对酶活性的去除最强。另外,不同的脱毒方式会改变b寡聚体的糖结合位点,从而导致脱毒后的pt产生不同的糖结合谱。
技术实现思路
1、本专利技术在针对pt抗原进行脱毒研究的大量实验中意外发现甲醛和戊二醛脱毒顺序是影响脱毒后疫苗的免疫原性和效价的关键因素。具体如下：
2、本专利技术所采取的技术方案是：一种百日咳毒素（pt）的脱毒方法，包括如下步骤：将pt抗原先用甲醛处理脱毒，再用戊二醛脱毒。
3、具体地，所述pt抗原为纯化后的pt抗原；
4、具体地，采用百日咳杆菌接种于琼脂培养基上，经多级培养后，离心分离培养上清和菌体部分，离心上清进行pt抗原的纯化。
5、具体地，将离心上清液采用硫酸胺进行沉淀，沉淀复溶后，通过层析纯化，得到纯化后的pt抗原。
6、具体地，可选择甘油作为抗聚集剂，将pt抗原中加入甘油，优选地，甘油终浓度10%~50%（v/v）。
7、具体地，第一次脱毒，甲醛终质量浓度0.1%~5%，优选地为0.2%~2%。
8、具体地，可加入促交联剂促进甲醛和蛋白交联反应。优选地，促交联剂浓度为0.01%~0.1%（w/w）。
9、更具体地，加入甲醛溶液后再加入赖氨酸盐酸盐溶液控温脱毒反应。
10、具体地，甲醛脱毒过程温度为10~50℃。
11、具体地，甲醛脱毒时间为1~50天。
12、具体地，第二次脱毒，戊二醛终质量浓度0.1%~5%，优选地为0.2%~2%。
13、具体地，戊二醛脱毒温度为10~50℃。
14、具体地，戊二醛脱毒温度为1~24小时。
15、具体地，戊二醛脱毒后，加入天冬氨酸盐终止反应。优选地，终浓度为0.1~1m。
16、具体地，终止反应结束后，通过透析或超滤方式去除甲醛、戊二醛，优选地，超滤方法。
17、本专利技术提供了一种由本专利技术所述的方法制备得到的脱毒pt。
18、具体地，本专利技术所述的脱毒pt抗原的分子量大于120kda。
19、具体地，本专利技术所述的所述脱毒pt抗原的平均粒径为10-20nm。
20、本专利技术提供一种无细胞百白破联合疫苗，包含百日咳鲍特氏杆菌（bordetellapertussis）液体培养物上清部分的pt抗原；所述pt抗原利用上述的方法进行脱毒。
21、具体地，疫苗还包含百日咳鲍特氏杆菌（bordetella pertussis）液体培养物上清部分的fha抗原；和/或，
22、百日咳鲍特氏杆菌上清和菌体部分的prn抗原；和/或，
23、白喉杆菌液体培养物上清部分的dt抗原；和/或，
24、破伤风杆菌液体培养物上清部分的tt抗原。
25、具体地，所述联合疫苗各本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种百日咳毒素（PT）的脱毒方法，其特征在于，包括如下步骤：将PT抗原先用甲醛处理脱毒，再用戊二醛脱毒。
2.根据权利要求1所述的百日咳毒素的脱毒方法，其特征在于，所述PT抗原为纯化后的PT抗原。
3.根据权利要求1-2任一项所述的百日咳毒素的脱毒方法，其特征在于，甲醛终质量浓度0.1%~5%。
4.根据权利要求1所述的百日咳毒素的脱毒方法，其特征在于，戊二醛终质量浓度0.1%~5%。
5.根据权利要求1所述的百日咳毒素的脱毒方法，其特征在于，甲醛脱毒温度为10~50℃。
6.根据权利要求1所述的百日咳毒素的脱毒方法，其特征在于，甲醛脱毒温度为1~50天。
7.根据权利要求1所述的百日咳毒素的脱毒方法，其特征在于，戊二醛脱毒温度为10~50℃。
8.根据权利要求1所述的百日咳毒素的脱毒方法，其特征在于，戊二醛脱毒时间为1~24小时。
9.根据权利要求1所述的百日咳毒素的脱毒方法，其特征在于，先在PT抗原中加入甘油，甘油终浓度10%~50%（V/V）。
10.根据权利要求
11.根据权利要求1所述的百日咳毒素的脱毒方法，其特征在于，所用天冬氨酸盐的终浓度为0.1~1M。
12.根据权利要求1所述的百日咳毒素的脱毒方法，其特征在于，终止反应结束后，通过透析或超滤方式去除甲醛、戊二醛。
13.一种脱毒PT抗原，其特征在于，所述的脱毒PT抗原由权利要求1-12任一项所述的百日咳毒素的脱毒方法制备得到。
14.权利要求13所述的脱毒PT抗原，其特征在于，所述脱毒PT抗原的分子量大于120KDa。
15.一种根据权利要求1-12中任一项所述的百日咳毒素的脱毒方法制备的无细胞百白破联合疫苗，其特征在于，包含百日咳鲍特氏杆菌（Bordetella pertussis）液体培养物上清部分的PT抗原。
16.根据权利要求15所述的无细胞百白破联合疫苗，其特征在于，还包含百日咳鲍特氏杆菌（Bordetella pertussis）液体培养物上清部分的FHA抗原；和/或，
17.根据权利要求15所述的无细胞百白破联合疫苗，其特征在于，所述联合疫苗各抗原的含量为每剂含PT抗原5~40μg，FHA抗原5~40μg，PRN抗原2~20μg，DT抗原2~20Lf，TT抗原2~5Lf。
18.根据权利要求15所述的无细胞百白破联合疫苗，其特征在于，所述PT抗原经脱毒后，与铝佐剂进行吸附。
...【技术特征摘要】
1.一种百日咳毒素（pt）的脱毒方法，其特征在于，包括如下步骤：将pt抗原先用甲醛处理脱毒，再用戊二醛脱毒。
2.根据权利要求1所述的百日咳毒素的脱毒方法，其特征在于，所述pt抗原为纯化后的pt抗原。
3.根据权利要求1-2任一项所述的百日咳毒素的脱毒方法，其特征在于，甲醛终质量浓度0.1%~5%。
4.根据权利要求1所述的百日咳毒素的脱毒方法，其特征在于，戊二醛终质量浓度0.1%~5%。
5.根据权利要求1所述的百日咳毒素的脱毒方法，其特征在于，甲醛脱毒温度为10~50℃。
6.根据权利要求1所述的百日咳毒素的脱毒方法，其特征在于，甲醛脱毒温度为1~50天。
7.根据权利要求1所述的百日咳毒素的脱毒方法，其特征在于，戊二醛脱毒温度为10~50℃。
8.根据权利要求1所述的百日咳毒素的脱毒方法，其特征在于，戊二醛脱毒时间为1~24小时。
9.根据权利要求1所述的百日咳毒素的脱毒方法，其特征在于，先在pt抗原中加入甘油，甘油终浓度10%~50%（v/v）。
10.根据权利要求1所述的百日咳毒素的脱毒方法，其特征在于，戊二醛脱毒后，用天冬氨酸盐终止反应。
11.根据权利要求1所述的百日咳毒素的脱毒方法，其特...
【专利技术属性】
技术研发人员：连红玉，郝擘，李军强，黄剑，陈列胜，朱涛，周朝东，
申请(专利权)人：康希诺生物股份公司，
类型：发明
国别省市：
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