稳定指示细胞自噬活动的表达载体及其建立和应用方法技术

本发明专利技术属于生物医学领域，旨在提供一种稳定指示细胞自噬活动的表达载体及其建立和应用方法。本发明专利技术通过构建含有ＥＧＦＰ－ＬＣ３自噬报告基因的慢病毒表达质粒，采用四质粒系统，建立能够使细胞稳定表达ＥＧＦＰ－ＬＣ３基因的慢病毒表达载体。使用该表达载体感染宿主细胞，可将ＥＧＦＰ－ＬＣ３基因稳定整合入宿主细胞基因组，使宿主细胞稳定高效表达ＥＧＦＰ－ＬＣ３，指示细胞自噬变化。应用该表达载体可建立稳定的自噬指示细胞，并采用基于Ｔｏｐ－ｈａｔ算子和形态滤波的图像分析方法快速定量分析细胞自噬改变。本发明专利技术具有自噬指示稳定可靠、实时灵敏、自噬定量快速准确、操作简便等特点，极大地方便了自噬观察分析，可广泛应用于自噬相关研究。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物医学
，涉及一种稳定指示细胞自噬活动的表达载体及其 建立和应用方法。
技术介绍
自噬是一种细胞自我降解消化的过程，是细胞的一种重要生命活动。在正常生理 情况下，细胞依靠自噬清除衰老或受损的细胞器、更新某些重要蛋白；在细胞处于应激状态 时，自噬激活增强，通过循环利用细胞内成份，维持能量和代谢稳态，清除受损蛋白质和细 胞器，限制氧化损伤等，是维持细胞自我稳态和生存的重要机制。因其与人类许多疾病关系 密切，特别是在肿瘤等重大疾病的发生发展中起重要作用，近年来成为研究热点，相关研究 与日俱增。自噬研究需要良好的自噬观察方法，理想的自噬观察方法应能够实时动态观察自 噬变化，并能够快速定量分析自噬改变，使用应简单便捷、观察稳定可靠，可重复性良好。传 统的自噬观察方法是使用透射电镜直接观察或通过吖啶橙染色荧光显微镜间接观察自噬 体，以及通过Western blot检测自噬关键分子LC3的改变，推测自噬之改变。由于这些观 察方法是对某个时间点的细胞内的自噬体或相关关键蛋白分子进行观察分析，因此无法 实现实时动态观察，此外，这些方法还存在其它不足①透射电镜法为最早应用的经典方 法，观察结果可靠，但是需要依赖透射电镜和精通自噬的技术人员完成图像观察分析和结 果判定，而透射电镜和技术人员在国内配置稀缺，实验室通常不具备，观察往往需要预约等 待，加上其观察样本制作过程繁琐，造成观察十分不便。同时由于电镜下观察视野有限和自 噬体判断分析不易，在进行定量分析(所需细胞数量级至少103)时往往由于工作量极大而 无法实现，因此该方法目前仅用于进行定性观察，辅助分析自噬改变；②吖啶橙染色荧光显 微镜法利用自噬体对吖啶橙染料的染色差异实现自噬的检测(吖啶橙将自噬体染成亮红 色，同时将细胞核和胞浆染成亮绿色)。但是吖啶橙对细胞外环境(如PH值)十分敏感，染 色特异性差，易于出现假阳性结果或假阴性结果，可重复性差，稳定性不足，兼之操作要求 高，应用已日益减少；③Western blot检测为目前普遍运用的方法。该方法利用自噬的 关键分子LC3在自噬发生过程中由LC3I变为LC3II，通过对LC3的改变检测自噬。这种方 法虽然相对有效可靠，但是使用十分不便，操作繁琐，检测步骤多、时程长，对技术及设备要 求较高，并只能进行半定量分析，此外，检测用抗体等试剂依赖进口、价格昂贵，以上种种因 素，使其难以成为一种简便易用的观察手段，在需要进行大量自噬观察分析(如进行多作 用因素、多作用水平对自噬影响的研究)时往往工作量极大，这在很大程度限制了其实际 使用。使用GFP荧光蛋白标记LC3形成GFP-LC3自噬报告基因标记细胞使细胞指示自 噬，借助荧光显微镜观察自噬活动，是近年来出现的一项新技术。这项技术使得实时动态、 迅速便捷地观察自噬成为可能。该方法利用自噬发生过程中自噬关键分子LC3由LC3I变 为LC3II，LC3在细胞内的分布发生改变(由LC3I的细胞胞浆内弥散分布变为LC3II的富集于自噬体上)，以GFP (绿色荧光蛋白)标记LC3分子，通过荧光分布的改变(由GFP-LC3I 弥散分布于细胞质之弥散绿色荧光变为GFP-LC3II富集于自噬体上形成绿色荧光亮点) 及变化程度来观察分析自噬的发生和发生强度。理论上，该方法具有实时动态观察、简便 快捷等诸多优势，但在实际工作中却不易实现。其主要问题在于缺乏能够高效稳定地将 GFP-LC3自噬报告基因导入细胞并使之稳定表达的表达载体，以及快速可靠的自噬定量分 析等应用方法。表达载体是将目的基因导入宿主细胞并使之表达的关键。目前广泛应用的 表达载体是携带GFP-LC3基因的重组表达质粒，通过脂质体转染方法(瞬间转染)转入细 胞内并使其在细胞内表达。这一方法存在诸多不足(特别是对于自噬研究尤为显著)① 转染效率低下对于自噬研究的对象细胞(肿瘤细胞、神经元、心肌细胞等)，大多数转染效 率低下(转染率一般不超过30%)；②不能稳定表达GFP-LC3基因瞬间转染通常不能将 目的基因整合入基因组，目的基因通常在细胞传代后表达即丧失，即使在瞬转后使用抗性 进行筛选纯化后也不能获得稳定表达的细胞株，多次传代后即丧失表达。以上两点使稳定 表达GFP-LC3，能够扩增传代的细胞难以建立。稳定表达GFP-LC3基因的自噬指示细胞难 以建立将导致研究所需的足够数量级的细胞难以获得，将由于分析细胞数量不足等原因导 致自噬定量分析无法实现，同时实验时将需要不断重复转染工作以获得研究所需细胞；③ 作用细胞类型有限对于一些难转染的细胞，如干细胞等、某些肿瘤细胞、间质细胞等，几乎 无法实现转染。这使得表达质粒的应用范围非常有限，很多细胞无法应用该方法进行自噬 研究；④转染试剂具有细胞毒性和自噬诱导作用转染试剂的毒性对细胞活力有很大影响 (如细胞活力下降等)，并可诱发自噬发生，这对于自噬研究至关重要。转染试剂的毒性作 用本身会诱发自噬，造成本底背景自噬很高，并在转染试剂去除后仍维持较长时间，在背景 自噬高的情况下，将难以准确判断自噬的发生及改变，转染试剂的毒性和自噬诱导往往使 该方法之应用陷入两难境地因为转染效率和表达效率低下，为获得高转染效率和高表达， 需要增加剂量，而剂量增加又导致细胞毒性作用和自噬诱导显著增加；⑤目前广泛应用的 GFP-LC3质粒的LC3是采用大鼠源性LC3序列，尽管大鼠LC3与人LC3有很高的同源性，但 是两者仍存在较大差别。目前绝大多数自噬研究在人源性细胞进行，继续沿用大鼠LC3将 影响研究的可信性。传统表达载体及相应方法的种种不足促使新表达载体及方法的出现。 慢病毒表达载体是近年来逐渐发展起来的一种新型表达载体，具有转染效率高(几乎所有 的晡乳动物细胞，接近100%的转染效率)，高效稳定持久的目的基因表达(目的基因经逆 转录后整合入宿主基因组)等优点，可克服传统表达载体及相应转染方法的诸多不足。但 是，尽管慢病毒载体系统克服了传统载体及转染方法的很多不足，但是目前研究报道采用 的慢病毒表达载体相对于自噬研究这一特殊领域仍然存在不足。其不足主要表现在表达载 体的表达质粒功能欠缺以及快捷有效的定量分析等应用方法缺乏①表达载体的表达质粒 采用CMV启动子实际应用显示CMV启动子活性对于GFP-LC3表达过高，易于表达过量，过 量表达GFP-LC3 —方面对于自噬研究，由于形成过强荧光背景，导致荧光斑点观察失真，影 响自噬指示和定量分析，另一方面对于细胞，持续过高表达GFP-LC3基因形成高细胞内压 力(stress)，导致较高程度的细胞毒性，影响细胞生长，细胞在传代后易于死亡，筛选稳定 株及扩增不易；此外，CMV启动子可能增加被转染细胞与母细胞的生物学特性差异。CMV的 这些不足需要相对温和的启动子；②标记蛋白常采用GFP :GFP荧光相对弱，为获得清晰的 图像和良好的观察，通常需要加大病毒/细胞比，加大的病毒量导致细胞死亡增加，未死亡的细胞则因为遭受过多病毒攻击而细胞活力受到较大影响，背景自噬水平增高，影响自噬 判断；③缺乏相应的稳定指示指示细胞系的建立方法不同的细胞类型对于慢病毒表达载 体的反应差异很大，而不同的慢病毒表达载体有其应用的特殊性，特别地对于建立自噬研 究使用的本文档来自技高网...

【技术保护点】
稳定指示细胞自噬活动的表达载体，其特征是：所述的表达载体采用慢病毒表达载体，由慢病毒表达质粒ｐＬＶ－ＵｂＣ－ＥＧＦＰ－ＬＣ３和包装质粒ｐＲｓｖ－ＲＥＶ，ｐＭＤ１ｇ－ｐＲＲＥ，ｐＭＤ２Ｇ四质粒组成，其中慢病毒表达质粒ｐＬＶ－ＵｂＣ－ＥＧＦＰ－ＬＣ３含有ＥＧＦＰ－ＬＣ３自噬报告基因；所述ＥＧＦＰ－ＬＣ３自噬报告基因为融合基因，由ＥＧＦＰ标记蛋白和人的ＬＣ３序列组成，采用Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ作为ＥＧＦＰ－ＬＣ３的启动子；应用表达载体感染宿主细胞后将ＥＧＦＰ－ＬＣ３基因整合至其基因组，使宿主细胞稳定持久表达ＥＧＦＰ－ＬＣ３，利用ＥＧＦＰ－ＬＣ３自噬指示功能，稳定指示细胞自噬改变。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：樊嘉，史颖弘，彭远飞，丁振斌，
申请(专利权)人：复旦大学附属中山医院，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]