【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于干细胞生物学领域，涉及人诱导多能干细胞的谱系特异性分化，具体涉及一种通过神经嵴细胞系制备间充质干细胞的方法和药物应用。
技术介绍
1、骨关节炎（osteoarthritis，oa）是一种以关节软骨退化、滑膜炎、软骨下骨硬化和骨赘形成为特征的慢性退行性疾病。世界范围内，有15%的人口患有oa；伴随着老龄化和肥胖化的发生，65岁以上人群中有80%会罹患oa；由于关节软骨无血管、无神经和无淋巴，一旦发生oa，很难自行愈合，通常带来严重的疼痛感和活动能力限制，继而影响患者的生活质量和加重经济负担。在对oa的临床治疗中，早期预防主要采用适度运动、外用非甾体抗炎药、口服对乙酰氨基酚和关节内注射皮质类固醇或透明质酸，这些方法在预防oa晚期进展方面效果有限；而晚期治疗时除了传统的骨髓刺激法、骨软骨移植等方法之外，采用细胞（包括软骨细胞和间充质干细胞mscs）治疗的方法也进入了临床应用视野。其中，mscs因其具备独特的免疫调节功能和软骨分化潜力，近年来已受到领域内研究者和生物医药科技公司的广泛关注。
2、mscs是一种专能干细胞，具有自我更新的能力和分化为骨、软骨和脂肪等成体组织细胞的潜能。mscs最初发现于骨髓，随后在人体和动物体的羊膜、脂肪、脐带、胎盘、牙髓等组织中均有发现。因其具有独特的抗炎特性、免疫调节功能和分化成成体细胞的能力，在细胞治疗和组织再生等领域具有广泛的应用前景。但是，使用自体或异体来源的原代mscs普遍存在一些问题：1）取材难度大，且提取的细胞数量有限；2）mscs的扩增能力和分化潜力有限；3）ms
3、因此，为了实现mscs在临床上的应用，迫切需要解决mscs的来源问题。除了在体提取（成体）mscs外，使用多能干细胞（pscs）诱导分化获得i-mscs也是mscs的重要来源。在体内，mscs的发育来源途径主要包括发育早期的中胚层细胞系和外胚层神经嵴细胞（nccs）系分化而来。为此，大量的研究仿生mscs的发育途径，在体外将pscs经中胚层细胞系或神经嵴细胞系逐步诱导分化得到mscs。其中，经过神经嵴细胞系得到mscs因获得的神经嵴细胞系具有自我更新能力和多潜能性（表型稳定），且最终诱导分化得到的msc成软骨分化能力强，更易得到透明软骨表型的软骨细胞，而更加适宜于骨关节炎的治疗和软骨损伤的修复。
4、当前，基于神经嵴细胞系诱导pscs分化得到mscs过程的研究主要涉及关键的两步诱导培养，包括pscs诱导分化成nccs和nccs诱导分化成mscs。其中，pscs诱导分化成nccs细胞系的过程主要涉及到smad信号通路（抑制）和wnt信号通路（激活）的调控，通过当前的调控策略获得的nccs往往纯度不高，需要经过流式细胞仪进行分选。
5、综上所述，虽然很多研究者已经研发出不少从hpscs在体外分化成mscs的方法，但现有的方法仍然不够成熟，比如需要使用血清等非特异性、随机性的成分将pscs诱导成mscs，还需要使用流式等技术筛选才能获得高纯度的细胞，因而分化效果不稳定、效率低、且时间长等问题；另外经由中胚层细胞系分化路径获得的mscs则由于中胚层细胞系不易于存储，使得细胞最终产率较低，而经由神经嵴细胞系路径获得的mscs由于神经嵴细胞自身的可扩增性和可存储性使得整个细胞生产过程可获得大量的二级细胞用于存储。
技术实现思路
1、本专利技术提供了一种从人多能干细胞（hpscs）分化为mscs的方法以及骨关节炎应用，
2、具体的，本专利技术采取的技术方案是：
3、本专利技术第一个方面提供了通过神经嵴细胞系制备间充质干细胞的方法，包含以下步骤：
4、s1：人多能干细胞诱导形成神经嵴细胞：向人多能干细胞加入特异性神经嵴细胞诱导分化培养基培养，并向特异性神经嵴细胞诱导分化培养基中加入yap激活剂；其中所述人多能干细胞为商业化人胚胎干细胞系或人诱导型多能干细胞；
5、s2：扩增培养该神经嵴细胞；
6、s3：扩增培养后的该神经嵴细胞向该间充质干细胞分化。
7、如上所述通过神经嵴细胞系制备间充质干细胞的方法，所述间充质干细胞表达cd90、cd73和cd105，不表达cd14、cd34、cd45和hla-dr。
8、如上所述通过神经嵴细胞系制备间充质干细胞的方法，所述间充质干细胞由表达p75和sox10而不表达pax6的神经嵴细胞诱导分化获得。
9、如上所述通过神经嵴细胞系制备间充质干细胞的方法，所述s3之后还包括s4：将间充质干细胞扩增培养。
10、如上所述通过神经嵴细胞系制备间充质干细胞的方法，所述s4之后还包括s5：将扩增培养得到的间充质干细胞进行鉴定。
11、如上所述通过神经嵴细胞系制备间充质干细胞的方法，所述s1之前还包括步骤s0：人多能干细胞的培养。
12、如上所述通过神经嵴细胞系制备间充质干细胞的方法，所述s1步骤为：将人多能干细胞的上清液吸除，加入所述特异性神经嵴细胞诱导分化培养基培养10天，并向所述特异性神经嵴细胞诱导分化培养基中依次加入如下信号通路调节剂：浓度为100nm-1μm 的bmp抑制剂0-2天，浓度为2μm-20μm 的activin、nodal、tgfb三种抑制剂之一0-3天，浓度为1μm-5μm 的gsk-3抑制剂3-6天和浓度为2μm-20μm 的yap激活剂6-10天；
13、所述特异性神经嵴细胞诱导分化培养基由以下成分组成：dmem/f12培养基、浓度为64mg/l的左旋抗坏血酸、浓度为14μg/l的亚硒酸钠、浓度为10.7mg/l的转铁蛋白、浓度为543mg/l的碳酸氢钠、浓度为19.4mg/l的胰岛素、浓度为100μg/l的成纤维生长因子2、浓度为2μg/l的转录生长因子β-3。
14、如上所述通过神经嵴细胞系制备间充质干细胞的方法，所述步骤s2为：
15、将所述特异性神经嵴细胞诱导分化培养基吸除，加入神经嵴细胞扩增培养基进行扩增培养7天，并向扩增培养基中添加浓度为2-20ng/ml的bfgf、浓度为5-50ng/ml的egf和浓度为2μm-20μm的如下三种抑制剂之一：activin、nodal和tgfb；在此期间神经嵴细胞使用冻存液进行冻存；
16、所述的神经嵴细胞扩增培养基由以下成分组成: dmem/f12培养基、浓度为64mg/l的左旋抗坏血酸、浓度为14μg/l的亚硒酸钠、浓度为10.7mg/l的转铁蛋白、浓度为543mg/l的碳酸氢钠、浓度为19.4mg/l的胰岛素、浓度为100μg/l的成纤维生长因子2、浓度为2μg/l的转录生长因子β-3；所述的冻存液包含二甲基亚砜和血清白蛋白。
17、如上所述通过神经嵴细胞系制备间充质干细胞的方法，所述步骤s3为：
18、本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.通过神经嵴细胞系制备间充质干细胞的方法，其特征在于,包含以下步骤：
2.根据权利要求1所述的通过神经嵴细胞系制备间充质干细胞的方法，其特征在于，所述间充质干细胞表达CD90、CD73和CD105，不表达CD14、CD34、CD45和HLA-DR。
3.根据权利要求1所述的通过神经嵴细胞系制备间充质干细胞的方法，其特征在于，所述间充质干细胞由表达P75和SOX10而不表达PAX6的神经嵴细胞诱导分化获得。
4.根据权利要求1所述的通过神经嵴细胞系制备间充质干细胞的方法，其特征在于，所述S3之后还包括S4：将间充质干细胞扩增培养。
5.根据权利要求4所述的通过神经嵴细胞系制备间充质干细胞的方法，其特征在于，所述S4之后还包括S5：将扩增培养得到的间充质干细胞进行鉴定。
6.根据权利要求1所述的通过神经嵴细胞系制备间充质干细胞的方法，其特征在于，所述S1之前还包括步骤S0：人多能干细胞的培养。
7.根据权利要求1所述的通过神经嵴细胞系制备间充质干细胞的方法，其特征在于，所述S1步骤为：将人多能干细胞的上清液吸除
8.根据权利要求2所述的通过神经嵴细胞系制备间充质干细胞的方法，其特征在于，所述步骤S2为：
9.根据权利要求1所述的通过神经嵴细胞系制备间充质干细胞的方法，其特征在于，所述步骤S3为：
10.根据权利要求1至9中的任意一项所述的通过神经嵴细胞系制备间充质干细胞的方法所获得的间充质干细胞作为骨关节炎药物的应用。
...【技术特征摘要】
1.通过神经嵴细胞系制备间充质干细胞的方法，其特征在于,包含以下步骤：
2.根据权利要求1所述的通过神经嵴细胞系制备间充质干细胞的方法，其特征在于，所述间充质干细胞表达cd90、cd73和cd105，不表达cd14、cd34、cd45和hla-dr。
3.根据权利要求1所述的通过神经嵴细胞系制备间充质干细胞的方法，其特征在于，所述间充质干细胞由表达p75和sox10而不表达pax6的神经嵴细胞诱导分化获得。
4.根据权利要求1所述的通过神经嵴细胞系制备间充质干细胞的方法，其特征在于，所述s3之后还包括s4：将间充质干细胞扩增培养。
5.根据权利要求4所述的通过神经嵴细胞系制备间充质干细胞的方法，其特征在于，所述s4之后还包括s5：将扩增培养得到的间充质干细胞进行鉴定。
6.根据权利要求1所述的通过神经嵴细胞系制备间充质干细胞的方法，其特征在于，所述s1之前还包括步骤s0：人多能干...
【专利技术属性】
技术研发人员：王先流，靳钧，欧阳平，
申请(专利权)人：上海元戊医学技术有限公司，
类型：发明
国别省市：
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