【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物活性肽，具体涉及一种β-乳球蛋白源纤溶酶抑制肽及其筛选方法和应用。
技术介绍
1、纤溶酶(plasmin)是牛奶中的一种碱性丝氨酸蛋白酶，该酶具有耐热性，可在大多数超高温灭菌处理中存活，因此，在直接超高温(duht)灭菌牛奶中，存活的纤溶酶会引起牛乳蛋白水解而导致产品出现不希望的沉淀和老化凝胶，对牛乳的保质期和风味产生不利影响。
2、目前，已有的纤溶酶抑制肽大多数是源自动物毒液中天然存在的多肽，经过分离纯化所得，问题在于此类抑制肽的原料获取难度高，价格昂贵，并且复杂的制备过程容易损失多肽的活力，使得最终产量普遍偏低，不利于后续的应用和研究。另外，此方法得到的纤溶酶抑制肽的序列通常大于50个氨基酸，序列中含有一个或多个含有二硫键的kunitz或者kazal类型结构域，难以实现工业化快速生产。因此，目前亟需一种能够从常见原料中获取纤溶酶抑制肽的方法，从而获得便于快速合成的纤溶酶抑制肽。
3、β-乳球蛋白是牛乳乳清中含量最多的蛋白，也是生产奶酪乳品企业的天然副产品。β-乳球蛋白原料获取容易，且研究表明β-乳球蛋白具有纤溶酶抑制活性。因此，本专利技术以β-乳球蛋白为来源制备纤溶酶抑制肽，具有巨大的潜力和经济价值。
技术实现思路
1、本专利技术为了解决现有技术中存在的纤溶酶抑制肽制备流程复杂耗时长、原料难获取且价格昂贵、产量偏低、产物结构复杂难以合成等缺陷和问题，提出了一种β-乳球蛋白源纤溶酶抑制肽及其筛选方法和应用，利用分子对接和分子动力学模拟的生
2、本专利技术的技术方案是：
3、本专利技术保护一种β-乳球蛋白源纤溶酶抑制肽，其氨基酸序列如seq id no.1所示。
4、本专利技术还保护一种β-乳球蛋白源纤溶酶抑制肽的筛选方法，包括以下步骤：
5、(1)分别获取纤溶酶和β-乳球蛋白的蛋白结构，完成纤溶酶和β-乳球蛋白的分子对接，并对β-乳球蛋白和纤溶酶复合体进行200ns的分子动力学模拟；
6、(2)分析β-乳球蛋白与纤溶酶交互作用界面，筛选β-乳球蛋白序列中与纤溶酶活性位点结合的多肽序列；其中，纤溶酶的活性位点为624his、667asp和762ser组成的三联体；
7、(3)根据纤溶酶抑制肽的序列具有在p1位点主要是赖氨酸和小部分精氨酸的特征，结合在纤溶酶活性位点附近覆盖的β-乳球蛋白氨基酸序列，选出合适多肽作为目标肽段，并根据序列合成该纤溶酶抑制肽。
8、进一步的，所述纤溶酶抑制肽通过固相合成法化学合成，其纯度≥98％。
9、进一步的，所述纤溶酶抑制肽包含8个氨基酸残基，分子量为905.08da。该纤溶酶抑制肽为小分子肽，可溶于0.01～0.1m pbs(ph 5.5-8)和dmso。
10、本专利技术还保护所述的β-乳球蛋白源纤溶酶抑制肽在制备溶纤酶酶抑制剂中的应用。进一步的，本专利技术保护所述纤溶酶抑制肽或者其任意比例的组合物在制备纤溶酶酶抑制剂中的应用。
11、所述的β-乳球蛋白源纤溶酶抑制肽在制备食品添加剂中的应用。
12、进一步的，所述食品添加剂应用于乳品中。
13、一种食品添加剂，其活性成分包括权利要求1所述的纤溶酶抑制肽。
14、所述的β-乳球蛋白源纤溶酶抑制肽在制备止血药物中的应用。
15、为了筛选制备β-乳球蛋白源纤溶酶抑制肽，本专利技术首先利用酶活动力学实验证明了β-乳球蛋白能抑制纤溶酶的活性；利用蛋白质数据库获得纤溶酶和β-乳球蛋白的结构数据文件；然后借助z-dock(3.0.2)和haddock(2.4)完成β-乳球蛋白和纤溶酶的分子对接，使用gromacs软件包对β-乳球蛋白和纤溶酶复合体进行200ns的分子动力学模拟；通过分析β-乳球蛋白与纤溶酶交互作用界面，筛选β-乳球蛋白序列中与纤溶酶活性位点结合的多肽序列。根据纤溶酶抑制肽的特性，选出合适多肽作为候选纤溶酶抑制肽。在筛选得到目标肽段后，采用固相化学合成方法合成该候选纤溶酶抑制肽，抑制活性实验验证该纤溶酶抑制肽的活性，得到所需要的纤溶酶抑制肽qtmkgldi。
16、将合成的纤溶酶抑制肽qtmkgldi加入到新鲜的直接超高温(duht)灭菌牛乳中，观察牛乳贮藏过程中的稳定性，明确该纤溶酶抑制肽能够延长duht牛乳保质期。
17、本专利技术的有益效果：
18、(1)本专利技术首次开展了β-乳球蛋白来源纤溶酶抑制肽的研究，制备获取了1条纤溶酶抑制肽；本专利技术利用分子对接技术和分子动力学模拟技术筛选纤溶酶抑制肽，依据多肽序列与纤溶酶的活性位点结合的特征，高效靶向从β-乳球蛋白序列中筛选纤溶酶抑制肽，避免了传统分离多肽的随机性；该方法所得肽段短，可实现固相化学合成大量制备，成本更低。
19、(2)本专利技术提供了一种新型β-乳球蛋白来源纤溶酶抑制肽的快速筛选方法，该方法选择牛乳中β-乳球蛋白作为纤溶酶抑制肽的来源，初步验证β-乳球蛋白具有抑制纤溶酶的能力后，对β-乳球蛋白和纤溶酶进行分子对接，对复合物进行分子动力学模拟至平衡状态，围绕纤溶酶的活性位点与β-乳球蛋白序列的交互作用，靶向筛选β-乳球蛋白序列中可能具有抑制活性的多肽序列，解决了目前纤溶酶抑制肽制备过程中原料稀缺、流程复杂和难以大规模生产等技术缺陷；
20、(3)本专利技术通过固相合成验证了筛选多肽的抑制能力，成功得到一条qtmkgldi纤溶酶抑制肽，该多肽增加了灭菌乳的稳定性，避免分层和老化凝胶的发生，能延长其保质期，进而延长了灭菌乳的货架期，具有良好的应用前景。
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1.一种β-乳球蛋白源纤溶酶抑制肽，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.根据权利要求1所述的β-乳球蛋白源纤溶酶抑制肽的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：
3.根据权利要求2所述的筛选方法，其特征在于，所述纤溶酶抑制肽通过固相合成法化学合成，其纯度≥98％。
4.根据权利要求2所述的筛选方法，其特征在于，所述纤溶酶抑制肽包含8个氨基酸残基，分子量为905.08Da。
5.根据权利要求1所述的β-乳球蛋白源纤溶酶抑制肽在制备溶纤酶酶抑制剂中的应用。
6.根据权利要求1所述的β-乳球蛋白源纤溶酶抑制肽在制备食品添加剂中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述食品添加剂应用于乳品中。
8.一种食品添加剂，其活性成分包括权利要求1所述的纤溶酶抑制肽。
9.根据权利要求1所述的β-乳球蛋白源纤溶酶抑制肽在制备止血药物中的应用。
【技术特征摘要】
1.一种β-乳球蛋白源纤溶酶抑制肽，其特征在于，其氨基酸序列如seq id no.1所示。
2.根据权利要求1所述的β-乳球蛋白源纤溶酶抑制肽的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：
3.根据权利要求2所述的筛选方法，其特征在于，所述纤溶酶抑制肽通过固相合成法化学合成，其纯度≥98％。
4.根据权利要求2所述的筛选方法，其特征在于，所述纤溶酶抑制肽包含8个氨基酸残基，分子量为905.08da。<...
【专利技术属性】
技术研发人员：易华西，张太，刘伊索，刘同杰，林凯，张喆，公丕民，张兰威，
申请(专利权)人：中国海洋大学，
类型：发明
国别省市：
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