一种功能增强型DC-CIK细胞的培养液及其培养方法技术

技术编号：40189933 阅读：14 留言：0更新日期：2024-01-26 23:52

本发明专利技术提供了一种功能增强型DC‑CIK细胞的培养液及其培养方法，属于细胞培养技术领域。本发明专利技术的培养液，包括培养液A、培养液B、培养液C；所述培养液A由包括如下组分制备：基础培养基、GM‑CSF、IL‑4、人参肽；所述培养液B由包括如下组分制备：基础培养基、CD3McAb、IFN‑γ；所述培养液C由包括如下组分制备：基础培养基、IL‑2、TNF‑α、牡蛎肽。本发明专利技术通过在培养液中添加植物肽和动物肽成分，增强DC细胞活性和抗原递呈能力，增强DC细胞对CIK细胞的激活反应，进而增强了DC‑CIK细胞活性和对肿瘤的杀伤能力。

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【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及细胞培养，尤其涉及一种功能增强型dc-cik细胞的培养液及其培养方法。

技术介绍

1、树突状细胞(dc细胞)，是目前已知的体内功能最强的抗原递呈细胞，能够刺激初始型t细胞增殖活化，识别肿瘤细胞，并能抑制肿瘤血管生成，同时激发免疫记忆保护。

2、细胞因子诱导的杀伤细胞(cik细胞)是将人体外周围单个核细胞在体外用多种细胞因子共同培养后而获得的一群异质细胞，它具有强大的抗瘤活性和非限制性杀瘤的优点，可用于任何一期的肿瘤患者。

3、dc-cik细胞免疫治疗是指利用dc细胞及cik细胞在体外共同培养大量扩增后，将活化的免疫细胞回输入患者体内的疗法。此疗法在直接杀伤肿瘤细胞的同时，辅助或刺激人体自身免疫系统，完善增强病人免疫机能，以抑制或杀灭肿瘤细胞。dc细胞被称为寻找肿瘤细胞的雷达，能够在体内随着血液全身各处主动搜索、识别肿瘤细胞，并把信息传递给免疫活性细胞，促使其激活和大量增殖。cik细胞被称为杀伤肿瘤细胞的精确导弹，该细胞对肿瘤细胞的精确识别杀伤能力很强，尤其对手术后或放化疗后的患者治疗效果显著，能清除残留的微小的转移病灶，防止肿瘤细胞的扩散和复发，并能提高机体免疫力。将dc与cik联合应用可以起到“1+1>2”的治疗效果。

4、目前的dc-cik细胞多采用外周血单个核细胞，通过添加多种细胞因子，以得到dc-cik细胞，如此方法培养得到的dc细胞数量少，抗原递呈能力差，dc-cik细胞对肿瘤的杀伤作用低。因此，亟需提供一种功能增强型dc-cik细胞的培养方法。

技术实现思路

1、本专利技术的目的在于提供一种功能增强型dc-cik细胞的培养液及其培养方法。本专利技术通过在培养液中添加植物肽和动物肽成分，增强dc细胞活性和抗原递呈能力，增强dc细胞对cik细胞的激活反应，进而增强了dc-cik细胞活性和对肿瘤的杀伤能力。

2、为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：

3、本专利技术提供了一种功能增强型dc-cik细胞的培养液，所述培养液包括培养液a、培养液b、培养液c；

4、所述培养液a由包括如下组分制备：基础培养基、gm-csf、il-4、人参肽；

5、所述培养液b由包括如下组分制备：基础培养基、cd3mcab、ifn-γ；

6、所述培养液c由包括如下组分制备：基础培养基、il-2、tnf-α、牡蛎肽。

7、优选的，所述培养液a中基础培养基为rpmi 1640培养基、dmem培养基或tg-t551培养基；所述培养液b中基础培养基为rpmi 1640培养基、dmem培养基或tg-t551培养基；所述培养液c中基础培养基为rpmi 1640培养基、dmem培养基或tg-t551培养基。

8、优选的，所述培养液a中gm-csf的终浓度为600～800u/ml，il-4的终浓度为600～800u/ml，人参肽的终浓度为50～100ng/ml。

9、优选的，所述培养液b中il-2的终浓度为100～600u/ml，cd3mcab的终浓度为200～280ng/ml，ifn-γ的终浓度为500～2000u/ml。

10、优选的，所述培养液c中tnf-α的终浓度为300～600u/ml，牡蛎肽的终浓度为120～250ng/ml。

11、本专利技术还提供了一种利用上述培养液培养功能增强型dc-cik细胞的方法，包括如下步骤：

12、(1)将单个核细胞贴壁培养，分离贴壁细胞和悬浮细胞；

13、(2)将步骤(1)所述贴壁细胞接种至培养液a中，培养，得到dc细胞；

14、(3)将步骤(1)所述悬浮细胞接种至培养液b中，培养，得到cik细胞；

15、(4)将所述dc细胞和所述cik细胞共同接种至培养液c中，培养，得到所述功能增强型dc-cik细胞。

16、优选的，所述贴壁培养的培养基为tg-t551培养基；所述贴壁培养的温度为35～38℃，时间为16～24h。

17、优选的，步骤(2)所述贴壁细胞接种后的浓度为1～5×106个/ml；所述培养的温度为35～38℃，时间为6～10天。

18、优选的，步骤(3)所述悬浮细胞接种后的浓度为3～8×105个/ml；所述培养的温度为35～38℃，时间为8～12天。

19、优选的，步骤(4)所述dc细胞接种后的浓度为1～5×103个/ml；所述cik细胞接种后的浓度为1～5×105个/ml；所述培养的温度为35～38℃，时间为5～10天。

20、本专利技术提供了一种功能增强型dc-cik细胞的培养液及其培养方法。本专利技术通过在dc细胞诱导培养液(培养液a)中添加gm-csf、il-4、人参肽，gm-csf促进dc细胞的生成，il-4抑制dc前体细胞向其他细胞分化，人参肽促进dc前体细胞成熟，并增强细胞活性。其中，人参肽中含有丰富的人参皂苷和多种氨基酸，能够透过细胞膜，为细胞提供必要的组分。进一步，本专利技术通过在cik细胞诱导培养液(培养液b)中添加cd3mcab、ifn-γ，促进cik细胞分化和增殖。最后，本专利技术通过在dc细胞和cik细胞共同培养过程中，添加il-2、tnf-α和牡蛎肽，利用il-2和tnf-α进一步促进dc细胞成熟，并利用牡蛎肽加强dc细胞提高对cik细胞的激活能力，促进cik细胞的增殖，提高dc-cik细胞的杀伤活性。其中，牡蛎肽中富含多种氨基酸，能够为细胞提供足够的营养成分。本专利技术所得到的dc-cik细胞纯度高、数量多、活性强，对肿瘤细胞的杀伤作用更强。

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【技术保护点】

1.一种功能增强型DC-CIK细胞的培养液，其特征在于，所述培养液包括培养液A、培养液B、培养液C；

2.根据权利要求1所述的培养液，其特征在于，所述培养液A中基础培养基为RPMI 1640培养基、DMEM培养基或TG-T551培养基；所述培养液B中基础培养基为RPMI 1640培养基、DMEM培养基或TG-T551培养基；所述培养液C中基础培养基为RPMI 1640培养基、DMEM培养基或TG-T551培养基。

3.根据权利要求2所述的培养液，其特征在于，所述培养液A中GM-CSF的终浓度为600～800U/mL，IL-4的终浓度为600～800U/mL，人参肽的终浓度为50～100ng/mL。

4.根据权利要求3所述的培养液，其特征在于，所述培养液B中CD3McAb的终浓度为200～280ng/mL，IFN-γ的终浓度为500～2000U/mL。

5.根据权利要求4所述的培养液，其特征在于，所述培养液C中IL-2的终浓度为100～600U/mL，TNF-α的终浓度为300～600U/mL，牡蛎肽的终浓度为120～250ng/mL。

6.一种利用权利要求1～5任一项所述培养液培养功能增强型DC-CIK细胞的方法，其特征在于，包括如下步骤：

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述贴壁培养的培养基为TG-T551培养基；所述贴壁培养的温度为35～38℃，时间为16～24h。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述贴壁细胞接种后的浓度为1～5×106个/mL；所述培养的温度为35～38℃，时间为6～10天。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述悬浮细胞接种后的浓度为3～8×105个/mL；所述培养的温度为35～38℃，时间为8～12天。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，步骤(4)所述DC细胞接种后的浓度为1～5×103个/mL；所述CIK细胞接种后的浓度为1～5×105个/mL；所述培养的温度为35～38℃，时间为5～10天。

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【技术特征摘要】

1.一种功能增强型dc-cik细胞的培养液，其特征在于，所述培养液包括培养液a、培养液b、培养液c；

2.根据权利要求1所述的培养液，其特征在于，所述培养液a中基础培养基为rpmi 1640培养基、dmem培养基或tg-t551培养基；所述培养液b中基础培养基为rpmi 1640培养基、dmem培养基或tg-t551培养基；所述培养液c中基础培养基为rpmi 1640培养基、dmem培养基或tg-t551培养基。

3.根据权利要求2所述的培养液，其特征在于，所述培养液a中gm-csf的终浓度为600～800u/ml，il-4的终浓度为600～800u/ml，人参肽的终浓度为50～100ng/ml。

4.根据权利要求3所述的培养液，其特征在于，所述培养液b中cd3mcab的终浓度为200～280ng/ml，ifn-γ的终浓度为500～2000u/ml。

5.根据权利要求4所述的培养液，其特征在于，所述培养液c中il-2的终浓度为100～600u/ml...

【专利技术属性】
技术研发人员：张军，杨业国，郑荣杰，苏晓萍，王卿，叶茂，刘维康，
申请(专利权)人：广东壹加再生医学研究院有限公司，
类型：发明
国别省市：

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